川木通的隨機擴增多態性DNA與序列特征性擴增區域標記研究

國錦琳，唐遠，裴瑾，萬德光

（成都中醫藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地 四川 成都 611137）

川木通類藥材來源于毛茛科鐵線蓮屬（Clematis spp.）植物的干燥藤莖，藥典收載的法定品種為小木通Clematis armandii Franch.和繡球藤C.montana Buch.－Ham.［1］。該屬植物我國分布有108種［2］，有些鐵線蓮屬植物外形極為相似，在非花期時植株難以鑒別，經過藥材加工后更加難以辨別，外觀形狀等常規鑒定較難區分，市場流通的川木通藥材涉及該屬10余種植物的藤莖，造成其品種混亂，影響到臨床用藥安全與療效。因此，在開發利用本屬藥用植物資源時，應重視和加強對其品種的鑒定，以確保藥材來源的正確性。

目前分子標記技術［3－9］已經在動植物的分類鑒定、遺傳多樣性分析方面發揮越來越多的作用，選擇操作簡單、穩定的分子鑒定技術進行中藥材的分子鑒定成為研究熱點。目前川木通類藥材的分子鑒定尚屬空白，我們選擇隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）法確定序列特征性擴增區域（sequence characterized amplified regions，SCAR）標記，對川木通分子進行快速準確的鑒定，為開發川木通類藥材的分子鑒定試劑盒奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及試劑

本實驗所使用的川木通原植物均為我們在四川省各地實地采集（表1）。植物葉片采集后或采用硅膠直接干燥，或直接編號后用液氮保存，再保存在－80℃冰箱備用。所采集植物均經萬德光教授鑒定。

宿主菌E.coli JM109，E.coli Top10為本實驗室保存。

Taq聚合酶購自上海申能博彩，dNTP、T4連接酶、瓊脂糖及PMD18－T載體購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應引物由成都法瑪基因科技有限公司合成，其他試劑采用國產分析純。

1.2 植物總DNA的小規模提取與DNA濃度的測定

提取方法按Virk等［10］的方法并稍加改進。

1.3 藥材DNA的小規模提取與DNA濃度的測定

提取方法按Virk等［10］的方法并稍加改進。

1.4 RAPD擴增

本實驗室RAPD擴增反應所采用的條件和體系如下：20μL體系，其中含1×PCR buffer，2.5mmol／L MgCl2，0.15 mmol／L dNTPs，1.0UTaq酶，0.5μmol／L 10－mer引物，50 ng模板DNA，補ddH2O至終體積20μL。PCR反應熱循環程序如下：95℃預變性5min，36℃復性1min，72℃延伸1.5min，94℃變性1min，36℃復性1min，72℃延伸1.5min，35個循環，最后72℃延伸10min，反應產物4℃保存。

1.5 電泳分析與川木通種間聚類分析

DNA擴增產物在1×TAE的緩沖條件下，于1.5%瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色。標準分子量為Tokara提供的DL2000Marker。使用凝膠成像系統（GDS8000，美國UVP）拍照分析。

擴增條帶結果記錄為1（有條帶）或者0（對應處無條帶），同時相同位置條帶亮度差別大于2倍以上，分別記錄為1（有條帶）或者0（對應處無條帶）。將原始數據輸入計算機獲得距陣，結果分析采用NTSYSpc 2.10e進行分析，可以直接獲得相似性系數、遺傳距離等數據［11］，對川木通進行種間聚類分析。選擇親緣關系較遠的川木通作為篩選引物的標準模板，按RAPD擴增，重復實驗2次，選擇多態性豐富、差異明顯的隨機引物作為后續RAPD－PCR反應的引物。

1.6 SCAR引物的設計

根據已經獲得的序列，使用軟件primer primer5.0按RAPD引物構建了相應的SCAR引物2對和從RAPD引物之后開始的引物2對。

1.7 SCAR引物的PCR擴增

PCR反應體系50μL，其中模板總DNA 10ng，dNTP 0.4mmol／L，引物濃度各0.2μmol／L，Taq酶2.5U。PCR反應條件為：94℃變性2min，30個擴增循環（94℃45s，60℃45s，74℃90s）后，再于74℃下延伸5min結束。

1.8 序列分析

測序結果在GenBank用BLAST程序進行同源性比較。基因序列分析采用DNAssist軟件。

2 結果

2.1 原植物DNA提取結果

200mg川木通葉提取DNA后，最后溶于50μL無菌水中，經測定其含量可達到100ng／μL（圖1）。

2.2 藥材DNA提取結果

1g川木通韌皮部提取DNA后，最后溶于20μL無菌水中，經測定其含量可達到80ng／μL（圖2）。

2.3 多態性良好的RAPD引物的篩選

最終從100條引物中篩選得到15條引物，多態性豐富，進行后續的RAPD擴增。

2.4 RAPD－PCR結果的分析

15對引物分別進行RAPD擴增，選擇多態性豐富、差異明顯的結果進行進一步分析，最終確定5條引物多態性豐富，差異明顯（表2）。5條引物擴增結果中共出現357條片段，其中330條具有多態性，多態率為92.4%，平均每條引物出現多態性片段數目為66條，多態性豐富。出現8條SCAR標記條帶，陽性標記C5標記序列的1條條帶存在于小木通、繡球藤、粗齒鐵線蓮和鈍萼鐵線蓮中；C13、K18標記的1條條帶僅存在小木通和繡球藤中，另外1條存在于小木通、繡球藤、粗齒鐵線蓮和鈍萼鐵線蓮中，考慮將其轉化為SCAR標記。

表2 5條入選引物的序列及擴增的條帶數目Tab.2 Amplification band numbers and sequences of five kinds of selected primers

2.5 川木通種間聚類分析

聚類分析顯示（圖3），以相似性系數約為1.52為域值，所有樣品可以分為兩大組。第一組包括除繡球藤以外的所有9個種，第二組僅包括繡球藤。以相似性系數約為1.422為域值，所有樣品可以分為三大組。第一組包括1、7、4、3、8、5、10共7個種，第二組包括6、9共2個種，第三組包括繡球藤1個種。3號與8號兩個種聚類在一起。

圖3 10種鐵線蓮屬作川木通用的植物UPGMA聚類分析圖Fig.3 UPGMA dendrogram of ten kinds of Clematis species based on Nei′s genetic distance

2.6 SCAR標記的構建和分析

在這5個RAPD引物標記中，選擇具有SCAR標記特征的條帶（可鑒定藥典品種）進行SCAR標記的建立，其中含1 062個堿基對（bp）的C13標記序列僅存在于小木通和繡球藤中：AAGCCTCGTCTGTTGAGTTCATCACCTTCAT GTTGTTTTGTTACCTCATGAAGAAAGGCATTTTT GTTGGTTCTACATTGGGAAGAGGAGTGCATCGTAG TTGGTTCTACCTCCGGAAGAGGAGTGCACCATATTT GGTTCTCTCTCATGAAGAGAAGCCCTTGTTTAGGCT GCCGAGACGTGTGTCCGGAACTTGTTATTAGATGCT TTCGTTGGTGGAGTTTTCTTGTAACTGAAGCATGGA CTTGTTATTGGCGTAAAGGGGAGCTTATGTCAGTTA GTTTATGAGACTCTTCTCTTGCCAAGCCTAAAATGT ACAACATTTGTACATATTGGCTTGAGGGGGAGTGTT GAGATATAACATAGTGTGAAATTGCTAGCCACCATA TTTACAGTGGGAGTCAACATAGTAAAAGTCATGCCT CTTTATCAGTGGTGCAGCCACCCTATCTATAAGGGA TGCCTCCATAGTTGACTTATGATGATTTGAGTATAG AGTGTATTAGTTGTTGTTTGTTGACCTTTGGGGTCT GTAATGGGTCTTTATAACTCATGTGGTCTAATGCAG TAAGAATTAATCTCTTCTATCAATTCATCTTTTTTG TGTTATTCTATTGCCTTCACAATGTAGTCATTTGTG TTCTTTCCTTTCATGTGTATATCTAGTCTTCTTCTCC ATTTCCATATCTTTGTTTCTATTACAATAAGGATCA AGGGATCCATGAAACTCTACAGTGGCATACTATAAC CTTGAGCATGTAGTATTGGTGGTGTCATTATATATG CCGGTGGATAAAATCCGGGGGTAGGAAACGTCTGTG GCAGACCATAACCTGGAAAACCATATAGAGAAGCAT ACGGCCAAGAAGGTGAAGCAAAAGAGGGCATACTTT GCATGGGAGACACATGATTTCCATACAAATTAACTC ATTGTTGACCTTGAATATAACCAAGGAACGGATTAG GCATGAACATGGCTTGAGAAGCTAGCCAAGCTTGGT AATTCTGATTCTGCTGATGAAGAAGTGCCATGTCTT GGTAATTTAATGTAGGACGAGGCTT。該序列在Gen Bank中進行BLAST，發現無功能性片段與之對應，每個片段首尾均包含10bp的隨機引物。根據已經獲得的序列，按RAPD引物構建了相應的SCAR引物2對和從RAPD引物之后開始的引物2對。SCAR引物：ScarC13上游為5′－AAGCCTCGTCTGTTGAGTT－3′，ScarC13 下 游 為 5′－AATGTAGGACGAGGCTT－3′。該SCAR引物可以采用1次PCR反應鑒定藥典品種，命名為ScarC13。

2.7 SCAR標記應用于川木通藥材的鑒定

分別采用上述獲得的SCAR標記引物作為鑒定引物，藥材DNA作為模板，進行PCR反應鑒定，ScarC13作為引物在小木通和繡球藤藥材處出現1062bp的陽性條帶，其它品種對應的位置為空白，因此ScarC13可以鑒定藥典品種。結果見圖4。

3 討論

鑒于市場流通的川木通藥材種類的復雜性，用常規的性狀鑒定、顯微鑒定和化學鑒定難于實現其快速準確的鑒定。根據中藥品質的遺傳主導論［12］，遺傳主導植物形態結構特征和生理功能特征，我們選擇其遺傳物質作為鑒定的主體，采用RAPD法進行親緣關系較近的多基原藥材的鑒定，為多基原藥材的鑒定提供了一種新方法。

基因組DNA的有效提取是實施PCR的前提和基礎，從干燥中藥中提取DNA模板一直被視為是生物鑒定的難題。由于中藥受炮制、生產、運輸和保存等方面的影響，導致中藥材的DNA嚴重降解，對提取和擴增造成極大困難。本實驗應用改進的Virk等［10］的方法進行DNA提取，通過對莖類藥材的DNA提取研究，確定了一種用于干藥材的提取方法，能夠得到純度較高的DNA。

圖4 ScarC13標記鑒定結果Fig.4 The result of ScarC13fingerprint

將本組藥材的RAPD擴增結果進行NTSYSpc 2.10e分析，獲得各自的相似性系數，以相似性系數約為1.422為域值，種間聚類分析可將所有樣品可以分為3組。其中，繡球藤為一個組，尾葉鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮為一個組，另一個組包括所有的其它樣品。鈍萼鐵線蓮和毛果鐵線蓮兩個種聚類在一起，與傳統分類中毛果鐵線蓮為鈍萼鐵線蓮的變種吻合。從生物聚類角度，小木通與繡球藤遺傳距離遠，其基因水平差異明顯，共同作為川木通的基原植物似乎不太合理，因此，將來有必要結合化學指標、藥效學指標對兩者進行綜合評價。

為了找到適合的SCAR標記以鑒定川木通品種，從100對RADP的隨機引物中篩選出5對多態性豐富的引物進行川木通10個種的擴增分析，最終得到C13為陽性SCAR標記。C13可以鑒定上述小木通與繡球藤，以及其主流品種粗齒鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮。但該片段較長，對于藥材鑒定較為困難，進一步需要設計100bp左右的片段構建試劑盒進行標準化快速鑒定。

與其他DNA遺傳標記鑒別方法一樣［13，14］，由于生物體內的遺傳信息不隨生物發育的不同階段而變化，同一個體的成、幼體階段和同一個體的不同器官具有同樣的遺傳信息，因此高特異性PCR鑒別不能區別出個體的發育階段和同種的器官組織的差異。此外，這種方法雖能在混合組分中檢測出是否有正品藥材成分的存在，但尚不能確定混合成分中被檢測組分的含量。

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