組織蛋白酶D酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)☆

周金橋 孫劍瑞 宋來君 劉宇

膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明。組織蛋白酶D酶原(procathepsin D，pCD)是組織蛋白酶D的前體形式，由392個(gè)氨基酸組成的分子量為52kD的無活性的蛋白酶原，與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)是分子量為90kD的II型跨膜糖蛋白，是細(xì)胞攝取鐵及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)所必需的蛋白之一。增殖旺盛的細(xì)胞TfR表達(dá)水平通常上調(diào)，而且腫瘤細(xì)胞的TfR表達(dá)更進(jìn)一步增高［2］。本研究采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR方法檢測(cè)pCD、TfR蛋白和mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并探討兩者的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2008年至2009年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤標(biāo)本52例，其中男27例，女25例，年齡12～68歲，平均(42±20)歲。根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(2007年)［3］，I-II級(jí)23例(脈絡(luò)叢乳頭狀瘤3例，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤5例，纖維型星形細(xì)胞瘤4例，原漿型星形細(xì)胞瘤6例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤5例)，III-Ⅳ級(jí)29例(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤7例，間變性星形細(xì)胞瘤4例，間變性少突膠質(zhì)瘤6例，髓母細(xì)胞瘤7例，膠質(zhì)肉瘤5例)。另收集對(duì)照非瘤腦組織12例(取自顱腦損傷患者內(nèi)減壓術(shù))，所有標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師確診。

1.2 免疫組織化學(xué)方法(ABC法)石蠟切片脫蠟，梯度酒精至水，EDTA法抗原修復(fù)液(pH 9.0)微波處理30 min，室溫冷卻，3 mL/L H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，1∶50的正常馬血清室溫孵育20 min。加1∶200的pCD 山羊多抗(Merck，IM04L)和1∶40的TfR(Novocastra，C 10F11)鼠一抗置于濕盒內(nèi)，4℃冰箱孵育過夜(12 h)。分別加1∶200的生物素標(biāo)記的抗山羊和抗鼠二抗，孵育45 min，ABC(1∶1∶50)室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2孵育，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)，最后蘇木素復(fù)染15～30 s和封片。陽性對(duì)照采用已知陽性切片，以PBS代替一抗做為陰性對(duì)照。染色陽性表現(xiàn)為細(xì)胞膜和/或胞漿成呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀，400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)高倍視野數(shù)取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為(－)，25% ～為(+)，50% ～為(++)，75% ～100%為(+++)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)應(yīng)用Trizon(康為)提取手術(shù)組織總RNA，并測(cè)定RNA的A260/A280值均在1.6～1.8之間。pCD上游引物5'TCACAGTCGTCTTCGACACG 3'，下游引物5'TTTCACCTCT CCGTCCAGAAA 3';TfR上游引物5'CGT GAT CAA CAT TTT GTT AAGATT C 3'，下游引物 5'CCA CAT AAC CCC CAG GATTCT 3'。內(nèi)參β-actin上游引物 5 CCACATAACCCCCAG GATTCT 3'，下游引物 5'TTCCAGTTTTTAAATCC TGAGTC 3'。反轉(zhuǎn)錄采用SuperRT Reverse Transcriptase試劑盒，反應(yīng)總體積為 25 μL，包含 2 μg RNA，0.5 mmol/L dNTPs，0.025 μg/μL oligo dT，5 μmol/L MgCl2，0.01 mol/L DTT，2 U/μL 的RNaseOUT TM抑制劑和2.5 U/μL的SSII RT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 pCD在膠質(zhì)瘤及非瘤對(duì)照組織中的表達(dá) pCD陽性免疫反應(yīng)主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，呈淡黃色至深淺不同的棕黃色顆粒(圖1 A)。在正常的腦組織，僅見極少量的神經(jīng)細(xì)胞膜輕度黃染，正常的膠質(zhì)細(xì)胞染色陰性;在Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜有少量黃染的顆粒，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)，pCD呈陽性表達(dá)(+);在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿中散在分布大量的棕黃色顆粒，pCD呈中度(++)至強(qiáng)陽性(+++)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析表明:與非膠質(zhì)瘤組織相比，I-II級(jí)膠質(zhì)瘤中pCD的表達(dá)明顯增高(χ2=2.873，P＜0.05);III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤分別與I-II級(jí)膠質(zhì)瘤、非瘤組織比較，pCD表達(dá)顯著增高(χ2=13.965，P＜0.05)。見表1。

2.2 TfR在膠質(zhì)瘤及非瘤對(duì)照組織中的表達(dá) TfR陽性免疫反應(yīng)主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，呈淡黃色至深淺不同的棕黃色顆粒，強(qiáng)陽性表達(dá)者也可彌散至細(xì)胞核(圖1 B)。在正常的腦組織的神經(jīng)細(xì)胞膜輕度黃染，呈弱陽性表達(dá);在Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜有中等程度的黃染顆粒，染色細(xì)胞數(shù)也較正常的腦組織多，呈中度陽性表達(dá);在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞膜、胞漿甚至在細(xì)胞核中彌漫性分布大量的棕黃色顆粒，少數(shù)細(xì)胞TfR也表達(dá)于細(xì)胞核，呈強(qiáng)陽性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，TfR在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)顯著上調(diào)(χ2=6.589，P＜0.05)。見表1。

2.3 RT-PCR結(jié)果膠質(zhì)瘤組織中pCD和TfR mRNA的表達(dá)高于非瘤組織(t=8.871，t=4.568，P ＜0.05)。見圖2。

圖1 pCD和TfR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。A:pCD在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的強(qiáng)陽性表達(dá)ABC(×200);B:TfR在III-Ⅳ膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)

表1 非腦瘤及不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織pCD和TfR的表達(dá)

圖2 pCD和TfR mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其半量分析。A:pCD mRNA在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的強(qiáng)陽性表達(dá)(t=8.871，P＜0.01);B:TfR mRNA在III-Ⅳ膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)(t=4.568，P＜0.05)。T表示膠質(zhì)瘤組織;N表示非瘤對(duì)照組織

3 討論

組織蛋白酶D酶原(pCD)在溶酶體內(nèi)低PH值作用下，它的激活肽段被切除后形成由雙鏈組成的成熟CD［4］。過度表達(dá)的組織蛋白酶D以pCD非激活形式被分泌到胞外，獲得自分泌絲裂原的能力，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和惡性疾病的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］。研究表明:位于pCD氨基端的激活肽段具有有絲分裂原活性，通過與細(xì)胞表達(dá)未知受體結(jié)合后發(fā)揮與生長(zhǎng)因子類似的活性［6］;體外和體內(nèi)pCD的轉(zhuǎn)染可促進(jìn)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，瘤體的生長(zhǎng)體積和速度與pCD的表達(dá)水平一致［7］。實(shí)驗(yàn)表明pCD在一些惡性腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等，并且與乳腺癌轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性呈高度相關(guān)性［6，8］，這些研究提示pCD的高表達(dá)與腫瘤的高危轉(zhuǎn)移、極差預(yù)后呈正相關(guān)。

對(duì)于以浸潤(rùn)生長(zhǎng)為主要生物學(xué)特征的膠質(zhì)細(xì)胞瘤pCD的表達(dá)情況，我們的研究結(jié)果表明:pCD在腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的表達(dá)是與腫瘤惡性程度有關(guān)，正常腦組織僅表達(dá)極少量的pCD，在Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤的異常細(xì)胞內(nèi)，呈陽性表達(dá)，在III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤樣本中，pCD的表達(dá)水平升高(P＜0.05);不同級(jí)別之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在III-Ⅳ的樣本中，pCD陽性細(xì)胞的數(shù)目也顯示出差異，高度惡性Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的陽性細(xì)胞數(shù)目多，認(rèn)為pCD對(duì)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)起重要作用。因此我們認(rèn)為，pCD表達(dá)量越多，越有利于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)，pCD的表達(dá)失調(diào)可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化過程中的重要分子事件，標(biāo)志著膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得了侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)是細(xì)胞攝取鐵及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)所必需的蛋白之一。TfR是細(xì)胞增殖所必需的，增殖旺盛的細(xì)胞通常TfR表達(dá)水平上調(diào)，腫瘤細(xì)胞的TfR表達(dá)更進(jìn)一步增高，故長(zhǎng)期以來是理想的治療靶點(diǎn)［9］。有研究表明鐵代謝失調(diào)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，如乳腺、肝、結(jié)腸、膀胱、肺等，而且TfR的表達(dá)增加還與腫瘤的分化程度和腫瘤的分級(jí)、分期、預(yù)后有關(guān)［10］。近年來，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)已建立了針對(duì)TfR治療性抗體，并在體內(nèi)、外的抗瘤研究中取得了良好的效果［11］。有學(xué)者還利用噬菌體展示技術(shù)篩選出了特異的抗TfR人單鏈可變區(qū)抗體片段(anti-TfR scFv)，與傳統(tǒng)的單克隆抗體比較，anti-TfR scFv表現(xiàn)出更強(qiáng)效的細(xì)胞毒性［12］。這些實(shí)驗(yàn)都進(jìn)一步表明增殖旺盛的細(xì)胞TfR表達(dá)水平通常上調(diào)，而且增殖旺盛腫瘤細(xì)胞的TfR表達(dá)更進(jìn)一步增高，侵襲能力強(qiáng)，與腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示III-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的TfR表達(dá)異常增高明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤和正常腦組織(P＜0.05)，而非瘤腦組織和Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)差異并不顯著;可能因?yàn)檎ＤX組織組織細(xì)胞及惡性度低、侵襲能力低的腫瘤組織細(xì)胞中也有著相似的TfR表達(dá)，故在Ⅰ-Ⅱ膠質(zhì)瘤和正常腦組織中TfR的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。可見膠質(zhì)瘤惡性程度越高，TfR表達(dá)量越多。TfR的高表達(dá)可以導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖旺盛，侵襲能力增強(qiáng)，對(duì)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移有極大的促進(jìn)作用。

為探討pCD和TfR在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)對(duì)膠質(zhì)瘤和非癌腦組織中pCD和TfR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了比較分析，結(jié)果也顯示膠質(zhì)瘤組織中pCD和TfR mRNA表達(dá)水平顯著增高，表明pCD和TfR不僅在蛋白水平存在差異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平的mRNA也存在著差異表達(dá)，二者在膠質(zhì)瘤組織與非瘤組織中的蛋白表達(dá)差異性表達(dá)可能是由于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控所引起。

pCD和TfR在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的侵襲性生長(zhǎng)過程中發(fā)揮了重要的作用，它們可能加速了病變的進(jìn)展，使瘤細(xì)胞的浸襲、轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，患者的預(yù)后更差，不僅可作為臨床評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤惡性程度和侵襲性的分子標(biāo)志，判斷患者的預(yù)后，而且pCD和TfR還可能作為膠質(zhì)瘤治療中非常有潛力的分子治療靶點(diǎn)。

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