小劑量MK-801對大鼠參照記憶、空間工作記憶和逆反學習能力的影響☆

李繼濤 蘇允愛 楊陽 馮瑜 黃潤虎 司天梅

認知功能障礙是精神分裂癥的核心癥狀之一［1］。目前精神分裂癥的動物模型多利用自發活動、前脈沖抑制和社會接觸等行為指標來模擬該疾病的陽性和陰性癥狀［2－4］，但對認知功能障礙的模擬尚處于探索階段。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑如苯環己哌啶(phencyclidine，PCP)和氯胺酮(Ketamine)可誘導正常人產生擬精神病癥狀或加重精神分裂癥患者的原有癥狀，而且已有研究發現急性或亞急性注射低劑量NMDA受體拮抗劑能夠在嚙齒類動物中模擬部分精神分裂癥的認知缺陷［5］。因此，本文以非競爭性NMDA受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽(dizocilpine，MK-801)為工具藥，利用Morris水迷宮測試系統，考察小劑量NMDA受體拮抗劑對大鼠參考記憶、空間工作記憶和逆反學習的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠61只，體重300～350 g，分三批購自北京大學醫學部實驗動物中心，分別用于考察參照記憶(22只)、空間工作記憶(16只)和逆反學習(23只)。每批動物均隨機分為MK-801組和對照組，同籠飼養，4只/籠，自由進食與飲水。實驗前大鼠在動物房飼養至少7 d，維持室溫(23±1)℃，濕度45% ～55%，12 h晝夜節律(08:00～20:00)。每天行為實驗前30 min將動物移入行為測試房適應環境。所有實驗均在09:00～12:00完成。

1.2 藥物與劑量 地卓西平馬來酸鹽 (dizocilpine，(+)-MK-801)購自美國 Sigma公司，溶于生理鹽水。每只動物每次行為測試前20 min腹腔注射給藥，給藥體積為2 mL/kg，注射劑量選為0.1 mg/kg，對照組給予相同體積的生理鹽水。

1.3 認知功能測試裝置和訓練程序

1.3.1 Morris水迷宮系統 由上海吉量軟件科技有限公司生產。為塑料的圓柱形水池，直徑185 cm，高45 cm，站臺直徑9 cm，實驗前加入適量黑色墨水以更好地隱藏站臺。水迷宮有4個象限，站臺位置位于象限中心，站臺沒于水面下2 cm。水池周圍有白色不透明窗簾圍繞，并貼有4種不同大小、形狀和顏色的標記物幫助大鼠空間定位。恒溫器維持水溫(23±1)℃，使用吉量視頻跟蹤軟件分析大鼠航行軌跡。大鼠完成適應訓練24 h后進行正式實驗。

1.3.2 認知功能測試 采用Morris水迷宮測試大鼠的3個認知能力［6］，即①參照記憶:每天分別從4個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找站臺所需時間，計為逃避潛伏期。若大鼠入水90 s內找到站臺，讓其在站臺上停留15 s;若90 s內未找到站臺，由實驗者引導其上臺，并臺上停留15 s，潛伏期按90 s計算。每次訓練間隔15 s。結果分析時取每天4次訓練潛伏期的均值來反映動物當天的學習能力。連續訓練4 d，入水點位置不變，但順序隨機排列。第5 d撤除站臺進行空間探索實驗，記錄大鼠60 s內在各象限的探索時間、穿越站臺次數等指標。結果分析時根據四個象限的性質，將其分為目標象限(站臺所在象限)、對立象限和相鄰象限三類。由于相鄰兩象限在位置上等價，因此將兩象限的相應指標平均后納入統計;②空間工作記憶:連續訓練6 d，操作同參照記憶，但每天隨機更換站臺位置，使后一天的訓練不依賴前一天的記憶。每天做2個試次，第1個試次定義為樣本試次(Sample trial)，第2個試次為匹配試次(Matching trial)，兩試次間隔15 s。結果分析時，分別將每只動物6 d的樣本試次或匹配試次進行平均，通過比較兩試次間潛伏期的變化來反映動物的空間工作記憶能力;③逆反學習能力:包括參照記憶和逆反學習兩個階段。首先將站臺固定在Ⅰ象限。每只動物連續訓練學習4 d，空間探索1 d。操作同參照記憶實驗，但期間不給藥。目的是讓每組動物均能學會將站臺定位在第Ⅰ象限中央。然后進入逆反學習階段，將站臺固定在Ⅲ象限中央。動物連續訓練學習4 d后，第5 d再次進行空間探索實驗。本實驗分析方法同參照記憶。以每只動物新目標象限與舊目標象限探索時間百分比的差值作為逆反指標來評價每只動物的逆反學習能力。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析。實驗結果以均數±標準誤表示。采用重復測量方差分析各實驗逃避潛伏期隨訓練天數或次數的變化趨勢，以組別作為組間因素，訓練天數(參照記憶和逆反學習)或訓練次數(空間工作記憶)作為組內因素;采用獨立樣本t檢驗比較空間探索組間差異;采用Wilcoxon配對秩和檢驗比較空間探索組內各象限間探索時間百分比。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 大鼠參照記憶能力的比較 定向航行實驗中，雙因素重復測量方差分析顯示訓練天數［F(3，60)=3.21，P ＜0.05］和組別［F(1，20)=377.80，P ＜0.001］對潛伏期有顯著影響，兩者之間無交互作用。與對照組比較，MK-801組動物訓練第2～4 d潛伏期顯著增加(P＜0.05)。空間探索實驗中，對照組在目標象限探索時間百分比多于相鄰象限和對立象限(P＜0.05)，但MK-801組在三個區域探索時間上差異無統計學意義(P＞0.05)。另外，與對照組相比，MK-801組穿越站臺次數明顯減少［(1.45±0.43)vs(0.18±0.12)，t=2.82，P＜0.05)］。見表1。

表1 小劑量MK-801對大鼠參照記憶潛伏期和空間探索實驗的影響

2.2 大鼠空間工作記憶能力的比較 雙因素重復測量方差分析顯示訓練試次與組別的交互作用顯著［F(1，14)=484.54，P=0.03］:對照組匹配試次的潛伏期顯著短于樣本試次(P＜0.05)，但MK-801組動物在兩試次潛伏期上無差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 大鼠逆反學習能力的比較 參照記憶階段未進行藥物注射。訓練結果發現兩組動物在每天平均逃避潛伏期、空間探索時間差異無統計學意義(P＞0.05)。逆反學習階段進行藥物注射后，雙因素重復測量方差分析顯示訓練天數(F(1，21)=3605.18，P＜0.01)和組別［F(1，21)=6.64，P＜0.05］對潛伏期有顯著影響，兩者之間無交互作用。見圖1。與對照組比較，MK-801組第2～3 d逃避潛伏期延長(P＜0.05)。空間探索實驗中，MK-801組在當前目標象限和原目標象限探索時間的差異無統計學意義(P＞0.05);以每只動物新目標象限與舊目標象限探索時間百分比的差值作為逆反指標來評價每只動物的逆反學習能力，與對照組比較MK-801組動物逆反學習成績顯著下降(t=3.08，P＜0.01)。見表3。

3 討論

精神分裂癥患者存在長時記憶、工作記憶、推理與問題解決能力等多個維度認知功能的障礙［1］，這些認知功能障礙嚴重程度與其生活質量的改善密切相關［7］。因此，建立精神分裂癥認知障礙的動物模型對于揭示該疾病的發病機制及評估藥物療效有著十分重要的臨床意義。嚙齒類動物腹腔注射NMDA受體拮抗劑MK-801建立精神分裂癥動物模型是目前公認的精神分裂癥藥理模型之一。我們前期研究發現急性注射MK-801可顯著增加小鼠的自發活動和刻板行為［2］以及引起前脈沖抑制的缺失［3］，模擬了精神分裂癥患者的陽性癥狀及感覺門控功能缺失等。本研究進一步發現，MK-801可顯著破壞大鼠長時記憶、空間工作記憶和策略轉換能力，在一定程度上模擬了精神分裂癥的認知障礙。

表2 小劑量MK-801對大鼠空間工作記憶的影響

圖1 小劑量MK-801對大鼠逆反學習實驗中定位航行實驗的影響。1)與對照組比較，經重復測量方差分析及簡單主效應分析，P＜0.05

表3 小劑量MK-801對大鼠逆反學習空間探索實驗的影響(%)

參照記憶反映了經重復訓練后動物對站臺位置的學習和記憶形成。本研究發現MK-801組動物逃避潛伏期顯著長于對照組，而且對目標象限的探索與其它象限沒有差異，提示腹腔注射小劑量MK-801破壞了大鼠的學習記憶能力，這與 Stuchlik等［8］和 Enomoto等［9］的研究結果一致。海馬的完整性對參照記憶十分重要。腦室注射NMDA受體拮抗劑AP5可破壞大鼠水迷宮定位航行的學習能力［10］，這主要是因為NMDA受體阻斷劑可破壞海馬長時程增強(LTP)的形成，而LTP被認為是學習記憶的生理基礎。臨床研究發現精神分裂癥患者在虛擬迷宮任務中潛伏期延長，而且在目標象限探索時間較對照組顯著減少［11］。這進一步驗證了應用Morris水迷宮任務模擬精神分裂癥患者認知障礙的可行性。

與反復訓練所形成的長時記憶不同，空間工作記憶實驗反映了對信息的短時存儲能力和操作能力。Dudchenko將嚙齒類動物實驗中工作記憶定義為“在一次訓練期間對所用到的物體、刺激或位置信息的短時記憶”［12］。在本實驗中，動物需依賴樣本試次中掌握的站臺位置信息來完成匹配試次找站臺的任務;而且站臺位置信息不影響第二天的訓練，因為站臺位置每天均不同。結果表明，MK-801組潛伏期在兩個試次上無顯著差異，說明MK-801破壞了動物對信息的暫時存儲能力。既往有研究者利用n-back任務［13］和T型水迷宮［14］均發現0.1 mg/kg MK-801對大鼠的工作記憶有顯著的破壞作用，本研究結果與其一致。由于Morris水迷宮的工作記憶涉及到空間信息，因此該任務可能由前額葉－海馬環路來介導。Yoon等［15］通過注射GABA-A受體激動劑蠅覃醇使內側前額葉或背側海馬暫時失活，均可導致大鼠空間工作記憶破壞;提示大鼠空間工作記憶依賴多個腦區的共同參與，神經網絡連接比較復雜。

在逆反學習任務中，動物需要抑制已經掌握的策略以學習新的策略，因此該任務反映了反應抑制和行為靈活性，即隨外界環境變化而轉化策略的能力。精神分裂癥患者在Wisconsin卡片分類任務上往往表現為對已掌握策略的保持性錯誤而無法轉換策略完成當前任務［16］。由于考察逆反學習的前提是動物已習得某種能力，而本研究中參照記憶的結果表明小劑量MK-801會導致動物無法習得站臺的空間位置，因此本研究中單獨購買了一批動物來保證兩組動物在進行逆反學習前的基線水平一致。研究結果表明，MK-801組在逆反學習階段潛伏期延長，而且空間探索任務上似乎無法區分新舊兩目標象限。本研究與Chadman等［17］發現急性腹腔注射MK-801 0.1mg/kg引起Long-Evans大鼠在T迷宮內的逆反學習損傷一致。腦區損毀研究表明，逆反學習能力與前額葉－紋狀體皮層的功能完整性密切相關［17］，提示MK-801可能通過引起該神經環路的異常而發揮作用。

既往研究提示，急性腹腔注射過高劑量(≥0.2 mg/kg)的MK-801可引起大鼠運動系統功能異常，使動物出現自發活動增多，刻板行為明顯以及共濟失調［8］，從而干擾認知任務的完成，因此本實驗中MK-801的注射劑量為0.1 mg/kg。根據我們以前的實驗，急性注射0.1 mg/kg MK-801對SD大鼠的自發活動并無影響，而且本文的三個實驗中，MK-801組和對照組在游泳速度上也無差異。這與以往研究一致［9］，說明注射0.1 mg/kg MK-801引起的認知破壞是特異性的，并沒有混淆運動系統功能異常這一因素。總體而言，本研究結果表明，大鼠注射小劑量MK-801可以作為一種可能的精神分裂癥認知障礙模型，且通過一種給藥方式和一套設備能夠從長時記憶、工作記憶和策略轉換等不同認知維度去模擬精神分裂癥患者的認知缺陷，具有很強的實用性。

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