S100A4基因在不同骨肉瘤細胞和組織中的表達

馬 旭，王巖峰，安貴峰，商冠寧，呂 剛

(1.沈陽市骨科醫院，遼寧 沈陽 110044；2.中國醫科大學 附屬第一醫院 骨科，遼寧 沈陽 110001)

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，惡性度高，預后差，易發生遠處轉移。近年來的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達與惡性腫瘤的生物學行為密切相關，特別在腫瘤的侵襲和轉移中發揮著重要的作用。S100A4有可能成為一種能夠預測腫瘤病情發展及指導臨床治療的指標。本研究檢測S100A4基因在不同的人骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中的表達情況，并分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

人骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS購自中科院上海細胞研究所。骨肉瘤組織選取中國醫科大學附屬第一醫院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例，對照組選取中國醫科大學附屬第一醫院2008年收治的骨軟骨瘤病例13例。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：細胞培養條件：37 ℃, 5 % CO2，DMEM/HIGH Glucose培養基+10 %標準胎牛血清。

1.2.2 細胞總RNA提取和Real-time PCR反應：使用Trizol試劑提取細胞總RNA并進行逆轉錄反應。Real-time PCR反應引物序列，目的基因S100A4：5'-GCCCTGGATGTGATGGTG-3'(上游)，5'-CGTTGTCCCTGTTGCTGT-3'(下游)，擴增產物184 bp；內參照β-actin：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'(上游)，5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'(下游)，擴增產物150 bp。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)進行Real-time PCR反應。反應條件：95 ℃，5 s(1次)；95 ℃，5 s；56 ℃，20 s；68 ℃，15 s(循環45次)。取PCR反應產物5 μL于含0. 5 μg/mL EB的2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.3 SP法免疫組化染色：石蠟切片，3 μm厚，脫蠟水化后進行免疫組化染色。用枸緣酸鹽緩沖液(pH 6.0)高溫修復抗原；用3 %過氧化氫室溫孵育10 min阻斷內源性過氧化氫酶的活性；正常山羊血清室溫封閉10 min；加入1∶100稀釋的兔抗人S100A4多克隆抗體(NeoMarkers)/鼠抗人CD44V6單克隆抗體(Maixin)后，37 ℃溫箱孵育150 min；滴加適當生物素化二抗工作液，37 ℃孵育20 min；滴加S-P液(ZYMED)，37 ℃孵育20 min；最后DAB顯色，蘇木素復染5 min，1 %鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗反藍；切片經過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)替代一抗作為陰性對照。

1.3 判斷標準

S100A4蛋白陽性表達的位置在骨肉瘤細胞的細胞漿，CD44V6蛋白陽性表達的位置在骨肉瘤細胞的細胞膜和近膜的胞漿，陽性細胞著色呈不同程度的黃色。每張切片分別計數5個不連續的高倍視野，計算平均陽性細胞數所占的百分比。按染色程度將陽性信號分為3 類：淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色強度×陽性細胞百分數為每例組織染色的綜合記分。陽性表達為綜合記分≥1，陰性表達為<1。

1.4 統計學方法

所有數據均使用SPSS11.0統計學軟件處理，采用t檢驗進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞培養

MG-63人骨肉瘤細胞呈圓形、多角形和梭形等多種形態。傳代后3 h左右即可見細胞相繼貼壁生長，8 h后細胞逐漸伸出胞突，變為多角形或不規則形， 24 h后見有較多新分裂的細胞附著于集落表面，核仁多個，為圓形或不規則形。U-2OS人骨肉瘤細胞呈圓形、扁平不規則多角形和短梭形等多種形態，中央有圓形核，上皮型細胞形態明顯。細胞的體積小于MG-63細胞，細胞貼壁生長，細胞數量達飽和密度后，細胞彼此緊密相連成單層膜狀。

2.2 Real-time PCR反應結果

Real-time PCR反應結果顯示，人骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中均有S100A4基因表達。用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測PCR產物。顯示骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之間的清晰條帶，表達程度接近；同時擴增兩種骨肉瘤細胞系的管家基因β-actin，表達程度也相近，片段小于S100A4基因。由于擴增的S100A4基因為184 bp的片斷，且骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之間的清晰條帶(圖1)，兩種細胞系均有S100A4基因的表達。管家基因β-actin的擴增片段的大小是150 bp，并且在各種細胞中表達程度相似。

2.3 免疫組織化學染色結果

S100A4蛋白在骨肉瘤組織中表達的陽性率是69.7%，陽性表達的位置在骨肉瘤細胞的細胞漿，呈棕褐色顆粒狀陽性反應(圖2a)，對照組未見S100A4蛋白表達。CD44V6蛋白陽性表達的位置在骨肉瘤和骨軟骨瘤細胞的細胞膜和近膜的胞漿，呈棕黃色陽性反應(圖2b、c)，在骨肉瘤組織中表達的陽性率是60.6%，在骨軟骨瘤中的陽性率僅為7.7%。

圖1 Real-time PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 S100A4蛋白與CD44V6蛋白表達的關系

本實驗檢測的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6蛋白的表達有一致性，經配對樣本t檢驗分析顯示S100A4和CD44V6蛋白的表達具有正相關性(r=0.413，P<0.05，表1)。

圖2 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤組織中的的表達 SP ×400

表1 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤中表達的關系

3 討 論

骨肉瘤是臨床常見的成骨性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20 %，其惡性程度高，好發于青少年，易復發和轉移，預后較差。隨著分子生物學理論和技術水平的提高，尤其是腫瘤分子生物學的發展，人們對骨肉瘤的發生機制在分子水平上有了新的認識。近年來的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達與惡性腫瘤的生物學行為密切相關，特別在腫瘤的侵襲和轉移中發揮著重要的作用[1-2]。有關S100A4蛋白與多種腫瘤生物學特性的研究已相繼開展。

S100A4基因是1989年由Sbralidze從高轉移性小鼠乳癌細胞中克隆出來的一種轉移相關基因[3]。1992年克隆了人類S100A4基因。該基因位于染色體1q21，基因全長2837 bp，編碼101個氨基酸的蛋白。該區易發生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變，提示S100A4基因與腫瘤的發生發展關系密切[4]。關于S100A4基因與腫瘤發展的分子機制的最初證據來源于對具有轉移性的鼠細胞系SR-3Y1的觀察[5]。其后的轉染實驗顯示,嚙齒動物及人類的S100A4可以誘導無轉移性的大鼠乳腺癌細胞系出現轉移征象[6]。與此相似的，將嚙齒動物S100A4基因轉染入鼠類惡性黑素瘤細胞系B16和人類乳腺癌細胞系MCF7增加了其向肺臟轉移的能力[7]。上述研究揭示了S100A4基因與腫瘤侵襲轉移行為之間的關系，驗證了S100A4基因的促腫瘤轉移作用。

本研究發現在人骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中，均有S100A4基因的表達，mRNA的含量相近，說明S100A4基因在不同人骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中的表達程度相近。因此，推測S100A4基因與骨肉瘤侵襲、轉移密切相關，為進一步的研究提供了依據。

CD44(cluster of differentiation 44)是1980年被發現并確認，由單一基因編碼的具有高度異質性的單鏈膜表面糖蛋白家族，可與多種配體結合，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的粘附作用[8]。人類CD44基因定位于11號染色體短臂(11p13)，長50～60 kb，由兩組外顯子(1～20)組成。一組編碼普遍表達的標準型CD44s；另一組稱為變異體CD44V。含有變異型外顯子V6編碼序列的CD44分子，即為CD44V6，與人類腫瘤關系密切。研究表明，CD44V6在多種腫瘤細胞表達上調或發生構型改變 ，即在腫瘤組織中呈高表達，而在正常組織中呈低表達或不表達。臨床研究發現[9-10]，CD44V6的過量表達與骨肉瘤、乳腺癌、胃腸道腫瘤、子宮頸癌和淋巴瘤等惡性腫瘤的發生發展，侵襲轉移以及手術后生存期長短密切相關。Shiratori等[11]對骨肉瘤細胞株(POS-1)轉染的20只鼠肺轉移情況研究證實，CD44V6的上調能促進肺轉移；Khan等[12]的研究也證實，上調腫瘤細胞表面CD44V6的表達，能顯著增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。

在本研究中，S100A4和CD44V6蛋白在選取的骨肉瘤組織中均有比較高的表達，而在對照組骨軟骨瘤中沒有表達或僅有少量的表達。據此可推測，骨肉瘤的發生發展與S100A4和CD44V6蛋白的異常表達有密切的關系。S100A4蛋白可以降低腫瘤細胞間粘附力、增加腫瘤細胞的運動能力、重塑細胞外基質、抑制細胞凋亡、促進細胞異常增生和促進新生血管生成。而CD44V6蛋白通過下面幾種方式影響腫瘤細胞：介導淋巴細胞與毛細血管或小靜脈中的高內皮細胞結合，使淋巴細胞穿過血管壁，并參與淋巴細胞的激活過程；與細胞外基質中的透明質酸、膠原蛋白、纖維蛋白、層黏蛋白等基質結合；與細胞骨架蛋白結合參與細胞偽足形成而參與細胞的遷移運動。本研究還發現，檢測的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6蛋白的表達具有正相關性，提示S100A4和CD44V6的表達可能有內在聯系。由此推測，S100A4和CD44V6可能通過對細胞外基質的調節作用而發生相互影響，降低細胞間粘附力，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。通過調控這些基因的表達，可能使骨肉瘤的生長、轉移受到抑制，為骨肉瘤的治療提供了新的思路。

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