香菇C91-3菌絲發酵液蛋白口服液抗腫瘤免疫機制的探討

鐘民濤，王曉麗，劉穎麗，劉 磊，李星云，張 偉，黃 敏

(大連醫科大學微生物學教研室，遼寧大連 116044)

香菇C91-3菌絲發酵液蛋白口服液抗腫瘤免疫機制的探討

鐘民濤，王曉麗，劉穎麗，劉 磊，李星云，張 偉，黃 敏

(大連醫科大學微生物學教研室，遼寧大連 116044)

［目的］探討香菇C91-3菌絲發酵液蛋白(LFP91-3)口服液的抑制腫瘤作用及機制。［方法］取60只昆明小鼠，隨機分6組后進行S180荷瘤，并對荷瘤小鼠分別給予蒸餾水和不同劑量的LFP91-3口服，觀察劑量對小鼠生存期的影響，確定LFP91-3的最適劑量。同時觀察口服最適劑量后荷瘤小鼠淋巴細胞增殖反應，血清IL-2和TNF-α含量的變化，以蒸餾水口服組為對照。［結果］LFP91-3口服液能延長荷瘤小鼠的生存期，且存在一定的劑量依賴關系。LFP91-3最適劑量組小鼠淋巴細胞增殖率，血清 IL-2和 TNF-α水平分別為(44.11±14.4)%，(48.33±16.7)pg/mL 和(84.27±16.88)pg/mL，明顯高于對照的蒸餾水組(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL 和(35.05±17.29)pg/mL，P＜0.05。［結論］LFP91-3口服液具有體內抑瘤作用，其抑瘤作用可能與機體免疫能力提高有關。

香菇發酵蛋白;抗腫瘤;IL-2;TNF-α

香菇又名香蕈或香椹，是名貴的食藥用菌之一，國內外對香菇多糖已有許多研究，認為其具有抗病毒、抗腫瘤、抗感染、免疫調節和刺激干擾素形成等作用。目前，已經開發出多種香菇多糖藥片和藥劑應用于臨床，配合手術、化療和放療可以提高療效，延長病人生存期［1-3］。香菇已被列為國內重點研究的抗癌資源植物之一。

香菇C91-3菌株為黃敏等多年篩選的一株真菌，經過生物發酵培養后，其發酵液具有明顯抗腫瘤作用［4-5］。香菇 C91-3菌絲發酵液蛋白(LFP91-3)是對香菇C91-3菌絲發酵液進行初步提取獲得的混合蛋白，抗腫瘤實驗發現其具有體外直接殺傷腫瘤作用，在體內抑制腫瘤生長，但給藥途徑是腹腔注射給藥［6-8］。因此本研究改善給藥途徑，進一步對LFP91-3口服液效果進行研究，為今后研制有效的抗腫瘤新藥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物:純系昆明小鼠，體重18～22 g，6～8周齡，雌雄各半(大連醫科大學實驗動物中心提供)。

1.1.2 香菇 C91-3菌絲:香菇 C91-3菌株由大連理工大學食用菌研究中心惠贈。

1.1.3 瘤 株:S180(小鼠腹水型肉瘤細胞株)由本教研室提供。

1.1.4 主要試劑:RPMl-1640:GIBCO U.S.A;小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所;刀豆蛋白(ConA):中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;四甲基偶氮唑蘭(MTT):北京華美生物工程公司;IL-2和TNF-α的ELISA試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司;依多靈香菇菌多糖片(福建省閩東力捷迅藥業有限公司出品)。

1.1.5 主要儀器:真空干燥機(大連醫科大學中心實驗室提供);CO2孵育培養箱(Thermo公司);酶標儀(BioRAD)。

1.2 方 法

1.2.1 LFP91-3的制備:香菇菌絲體發酵后收集發酵液，發酵液經離心、鹽析、透析除鹽及濃縮，具體方法參照文獻［8］，最后制成口服液。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立，動物分組和給藥:S180腫瘤細胞連續在昆明小鼠腹腔傳代兩代以上，選傳代后6～7 d的小鼠，腹腔抽取腹水瘤細胞，Hanks液洗2次，調整細胞數至5×107/mL。取60只昆明小鼠，0.2 mL/只于小鼠腹腔接種腫瘤細胞。荷瘤小鼠分別于建模24 h隨機分成6組:蒸餾水組、環磷酰胺(CTX)組、香菇多糖(LNT)組、香菇C91-3菌絲發酵液蛋白(LFP91-3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。每組10 只，荷瘤24 h 后分別予蒸餾水、CTX 0.6 mg、LNT 0.1 mg、LFP91-3125、250、500 μg，每次 0.5 mL/只，在第 1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃給藥，共計 8 次，分別觀察6組荷瘤小鼠的生存期，探討香菇LFP91-3的最適劑量。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫功能指標的測定:另取20只昆明小鼠，建模方法同上，荷瘤后隨機分為兩組:蒸餾水組、LFP91-3最適劑量組。每組10只，荷瘤24 h后分別予蒸餾水、LFP91-3最適劑量，每次 0.5 mL/只，給藥時間同上。于接種腫瘤細胞后第16天處死小鼠，各組小鼠分別摘除眼球取血，之后脫頸處死取脾進行下一步實驗。

(1)淋巴細胞增殖反應實驗:各組小鼠脫頸處死后，無菌取脾，放入Hanks液中剪成糊狀(組織研磨器)，200目不銹鋼網(細胞網)過濾分成單個脾細胞，無菌三蒸水休克Rbc 30 s，加等量體積1.7%無菌NaCl恢復等滲，加入5 mL Hanks液中，離心1500 r/min，10 min，棄上清，加 2 ～3 mL RPMl-1640 液1500 r/min離心5 min，洗2次后懸于培養液中，臺盼藍染色法判斷細胞活性在95%以上，調整濃度為5×106/mL。采用MTT比色法測定淋巴細胞增殖反應［9］。

(2)血清IL-2和TNF-α含量的測定:將各組小鼠摘取的眼球血離心，制備血清。用小鼠IL-2和TNF-α的ELISA檢驗試劑盒，按試劑盒上的說明書操作。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 LFP91-3口服液對荷瘤小鼠生存期的影響

如表1所示，CTX組、LNT組和 LFP91-3組均能顯著延長S180腫瘤細胞所致腹水型荷瘤小鼠的存活時間，與蒸餾水組比較差異具有顯著性意義(P＜0.05);LFP91-3Ⅰ組與CTX組的存活時間比較差異無顯著性意義(P ＞0.05);LFP91-3Ⅱ、Ⅲ組的存活時間均長于CTX組和LNT組(P＜0.05)，且荷瘤小鼠的存活時間在適宜范圍內隨LFP91-3濃度的增大而延長，存在一定的劑量依賴關系。從而確定LFP91-3最適劑量為 LFP91-3500 μg。

表1 LFP91-3對S180荷瘤小鼠生存期的影響Tab 1 Effect of LFP91-3on life span in mice bearing S180 tumors

2.2 LFP91-3對荷瘤小鼠淋巴細胞增殖率、血清IL-2和TNF-α含量的影響

荷瘤小鼠淋巴細胞增殖率的測定結果見表2。LFP91-3最適劑量組小鼠的淋巴細胞增殖率明顯高于蒸餾水組(P ＜0.05)。而且，LFP91-3最適劑量組小鼠的IL-2和TNF-α含量與蒸餾水組比較，差異也有顯著性意義(P ＜0.05)，LFP91-3最適劑量組均高于蒸餾水組。

3 討 論

腫瘤傳統的治療方法有腫瘤切除手術、放療和化療，但給病人機體造成極大損傷，特別是對免疫系統的影響，往往會導致腫瘤細胞逃避機體的免疫監視而形成擴散或復發。免疫狀態低下是惡性腫瘤的重要生物學特征之一，香菇多糖雖已被證明具有抗腫瘤作用，并且是通過刺激機體免疫系統增強其免疫功能來達到間接抗腫瘤的目的，但其能否直接殺傷腫瘤細胞還尚未有定論［10-11］。目前臨床上應用香菇多糖(如天地欣等)作為輔助藥物參與腫瘤治療，有助于術后恢復［12］。環磷酰胺屬于臨床的化療藥物，雖能殺傷腫瘤細胞，但是其副作用大，并導致機體免疫功能低下。因此，在癌癥的治療中找到一種既殺傷腫瘤細胞又重建或增強機體免疫功能的藥物具有相當重要的意義［13］。

表2 LFP91-3對S180荷瘤小鼠淋巴細胞增殖率、血清IL-2和 TNF-α的影響Tab 2 Effect of LFP91-3on lymphocyte proliferation，serum concentration of IL -2 and TNF- α within mice bearing S180 tumor

香菇C91-3菌絲發酵液蛋白(LFP91-3)已被證實具有體外直接殺傷腫瘤的作用，在體內可抑制腫瘤生長，但給藥途徑是腹腔注射給藥［8］。因臨床上口服給藥能顯著提高癌癥患者的生活質量，且劑型易于制備，成本較低，使用時無需特殊護理，具有方便和經濟的優點。因此，本實驗選用LFP91-3口服液對S180細胞荷瘤小鼠的抑瘤效果及其抗腫瘤機制進行探討，結果發現香菇C91-3菌絲發酵液蛋白經口服給藥后可明顯延長S180荷瘤小鼠生存時間，抗腫瘤效果與香菇多糖和環磷酰胺無明顯差異，且荷瘤小鼠的存活時間在適宜范圍內隨LFP91-3濃度的增大而延長，存在一定的劑量依賴關系。同時，香菇菌絲發酵液蛋白LFP91-3口服后還能促進荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞對ConA的增殖反應，而且增加了IL-2和TNF-α的分泌。IL-2是由活化的T細胞產生的細胞因子，同時IL-2又可活化T和B細胞，參與細胞免疫功能。TNF-α能誘導B淋巴細胞的增生和分化，產生腫瘤特異性抗體，從而產生抗體介導的體液免疫抗瘤效應;同時，TNF-α能誘導B淋巴細胞分泌細胞因子激活巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞，并協同刺激T細胞增殖從而參與免疫調節，同時，淋巴細胞增殖反應也是反映機體免疫功能的有效指標［14-15］。提示 LFP91-3口服液抗腫瘤作用機制是通過調節和增強機體免疫功能達到對腫瘤的抑制作用，至于LFP91-3口服后有沒有直接殺傷腫瘤作用，還有待深入研究。

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Anti- tumor effect of proteins from lentinus edodes C91-3mycelium's fermentative liquid in vivo

ZHONG Min -tao，WANG Xiao-li，LIU Ying-li，LIU Lei，LI Xing-yun，ZHANG Wei，HUANG Min
(Department of Microbiology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

Abstract:［Objective］The anti- tumor mechanism of oral protein liquid from C91-3lentinus fermentative liquid(LFP91-3)was studied in this experiment.［Methods］Sixty mice in the S180 tumor models were randomly divieded into 6 groups and then were orally given LFP91-3in different doses and water as control to research the effects of LFP91 -3 liquid，on survival and find the optimal dose of the drug.Then lymphocyte proliferation，and serum content changes of IL -2 and TNF-α of the mice in the optimal dose group were observed in comparison to those in water group.［Results］Oral LFP91-3liquid could prolong the survival time of mice in the S180 tumor models，the spleen lymphocyte proliferation rate and serum IL - 2 and TNF - α concentrations of the group with optimal dose of LFP91-3were(44.11 ± 14.4)%，(48.33 ±16.7)pg/mL，(84.27 ±16.88)pg/mL，respectively，being higher than those of group with water(18.04 ±8.72)%，(30.5 ±3.58)pg/mL，(35.05 ±17.29)pg/mL，(P＜0.05).［Conclusion］Oral LFP91-3liquid have potentiality to inhibit cancer，which maybe associate with immunity increasing effect of the drug.

Key words:lentinus edodes fermentative protein(LFP);anti-tumor;IL-2;TNF-α

R730.5

A

1671-7295(2011)06-0551-03

2011-06-22;

2011-09-26

鐘民濤(1978-)，遼寧大連人，講師，博士研究生。

黃 敏，教授，博士生導師。E-mail:huangminchao@163.com