核轉錄因子E2F-1、P27在大腸癌中的表達及意義

楊建華，王 蕾，周世廣，劉春海，瞿 峰，時志民，孫冬霞

(1. 邯鄲市中心醫院 病理科, 河北 邯鄲 056004；2. 河北工程大學醫學院，河北 邯鄲 056002)

近年來，許多研究認為腫瘤實際是一種細胞周期病，即細胞周期啟動、運行和終止異常，細胞增殖過多，凋亡減少，腫瘤形成。在細胞周期中G1-S是控制細胞周期進程的最關鍵環節，因為在G1期中存在一限制點(restriction point，R點)。在R點之前，細胞周期的運行依賴于細胞外生長因子，而一旦細胞周期跨過R點，細胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細胞周期的運行和完成是至關重要的[1-2]。其中，核轉錄因子E2F-1、P27對調節細胞由G1期進入S期起著至關重要的作用。本研究采用免疫組化SP法檢測人大腸癌中E2F-1和P27的表達，探討兩者與大腸癌的臨床病理關系。

1 材料和方法

1.1 組織標本

收集選取2006年1月-2010年12月在河北工程大學附屬醫院進行大腸癌根治性切除經病理確診的大腸癌78例，所有病例根治性手術前均未行化療或放療。78例患者中，男53例，女25例；年齡39～79歲，平均(59.3±20.3)歲；淋巴結轉移43例，無淋巴轉移35例。按WHO分類標準(1996)進行組織學分級：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根據國際抗癌聯盟(UICC)1997年修訂的TNM分期標準進行分期。同時取同期手術切除和結腸鏡活檢并經病理確診的大腸腺瘤30例，另取癌旁10 cm以上正常大腸黏膜20例作為對照組。

1.2 方 法

試劑：兔抗人E2F-1多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，鼠抗人單克隆抗體P27和即用型S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

步驟：采用免疫組化SP法，玻片經多聚賴氨酸行防脫片處理，微波抗原修復。染色過程按試劑盒說明操作。

1.3 結果判斷

切片免疫組化染色以已知陽性的肺癌為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。染色均以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，兩名病理醫生在顯微鏡下計數10個高倍視野，按陽性細胞所占百分比并參考著色強度分級如下：(-)：陽性細胞數<10%；(+)：陽性細胞數10%～24%；(++)：陽性細胞數25%以上。

1.4 統計學方法

使用SPSS16.0統計軟件分析數據，各組間比較用χ2檢驗，應用非參數統計中Spearman等級相關對E2F-1和P27在大腸癌中表達的相互關系進行分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 E2F-1和P27在大腸癌中的表達

E2F-1和P27陽性物質分布于細胞核，見圖1、2。大腸癌E2F-1陽性表達率明顯高于正常大腸黏膜和大腸腺瘤(P<0.05)，正常大腸黏膜和大腸腺瘤E2F-1陽性表達率差異無顯著性意義(P>0.05)；P27在正常大腸黏膜中的陽性表達率明顯高于大腸腺瘤以及大腸癌，P27陽性表達在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌之間差異具有顯著性意義(P<0.05)，見表1。

圖1 大腸腺癌中E2F-1呈細胞核陽性表達 SP ×400

圖2 大腸腺癌中P27呈細胞核陽性表達 SP ×400

表1 正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1、P27的表達

2.2 大腸癌組織中E2F-1和P27表達與臨床病理指標之間的關系

在大腸癌組織中，E2F-1和P27的表達與患者的性別、年齡、大小無明顯相關關系(P>0.05)。但E2F-1和P27表達與大腸癌的病理分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關(P<0.05)。且隨著病理分級、臨床分期的增高，E2F-1表達逐漸增高而P27表達降低，見表2。

2.3 大腸癌組織中E2F-1與P27表達的關系

對大腸癌組織中E2F-1與P27表達水平進行相關性分析，E2F-1陽性表達的48例大腸癌中，2例P27陽性表達,E2F-1與P27表達呈顯著負相關(P<0.01,r= -0.393)。

表2 大腸癌組織中E2F-1、P27的表達與臨床病理特征的關系

3 討 論

大腸癌的發生是一個漸進過程。它經歷了正常大腸黏膜-上皮增生-腺瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級-不典型增生-原位癌-大腸癌-轉移的演進過程。早期階段主要是細胞過度增生，進一步發生細胞增生調控紊亂，最終導致早期癌和轉移，目前尚不清楚是哪些基因在腫瘤進展的哪個階段發生突變或失調。但是，研究確定在G1期中存在一限制點(restriction point,R點)。一旦細胞周期跨過R點，細胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細胞周期的運行和完成至關重要[1-2]。其中，核轉錄因子E2F-1對調節細胞由G1期進入S期起著至關重要的作用，轉錄因子E2F-1可與DP蛋白家族(DP1和DP2)結合形成異二聚體，增強其轉錄活性；也可與Rb結合形成異二聚體，抑制其轉錄活性[3]。

研究發現，E2F-1在多種腫瘤的發生發展過程中發揮了復雜的作用，起到癌基因或抑癌基因的作用。在食管鱗狀細胞癌、胃癌和涎腺腫瘤中均可見到E2F-1的過度表達[4-7]。在小細胞肺癌，E2F-1可以作為一種生長促進因子，促進腫瘤增殖，是預后不好的指標[8]。但是，也有一些實驗結果卻表明[9-11]，E2F-1的過表達可以終止細胞的過度增生和誘導細胞凋亡，起到抑癌基因的作用[12]。

作者在對人大腸石蠟標本研究中發現，E2F-1更多的表現為癌基因的作用。在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1蛋白陽性表達逐漸增高。在大腸癌組中E2F-1蛋白的陽性表達率明顯高于正常組和大腸腺瘤組。由此推斷在大腸癌的發生過程中，E2F-1過表達起到了促進作用。同時，在大腸癌組織中，E2F-1陽性表達與大腸癌的組織分級、臨床病理分期以及淋巴結轉移有關。且隨著大腸癌組織分級和臨床病理分期增高，E2F-1表達也逐漸增強，表明E2F-1的過表達在一定程度上可以反映大腸癌的生物學特性，其表達水平越高，腫瘤的侵襲力越強，惡性度就越高。

p27 是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 (cyclin - dependent kinase inhibitors,CKI)家族中的重要一員，是一種抑癌基因，在多種腫瘤中發現有該蛋白水平下降[13]。p27可直接抑制cyclin - CDK復合物的生物學活性，使細胞停滯于G1期，同時具有促進細胞分化、介導細胞間黏附及誘導凋亡等功能[14]。本實驗研究發現，P27從正常大腸黏膜到大腸腺瘤到大腸癌中表達逐漸下降，提示P27在大腸癌的發生中可能起重要作用。本實驗研究亦發現P27蛋白表達與大腸癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期以及淋巴結轉移均有關。P27蛋白水平在低分化、有淋巴結轉移、腫瘤轉移時降低，提示P27蛋白表達率降低的大腸癌更易發生淋巴結及遠處轉移和肌層浸潤。故認為P27低表達是大腸癌預后不良的一個獨立指標。P27蛋白表達與腫瘤的惡性程度負相關，可能為P27的低表達時，對G1/ S期轉換的抑制作用減弱，使細胞更易進入S期；P27表達能影響細胞間接觸，下調P27能抑制細胞粘附從而促進腫瘤細胞擴散。

此外，本研究對E2F-1與P27相關性進行分析發現，在大腸癌中，E2F-1的高表達伴隨著P27低表達，二者呈負相關；也說明二者在大腸癌中分別起著癌基因和抑癌基因的作用。

總之，在大腸癌組織中E2F-1過度表達以及P27表達缺失，對大腸癌的發生發展起著重要作用,檢測E2F-1和P27在腫瘤組織中的表達情況可能成為評價腫瘤患者預后的重要指標。

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