磷酸肌酸的腦保護作用研究

金 越，韓國柱，李 穎，馬郁芳，周 琴，孫慧君

(1. 大連醫科大學 藥學院 藥理教研室，遼寧 大連，116044； 2. 大連醫科大學 藥學院 臨床藥理教研室，遼寧 大連 116044； 3.大連醫科大學 生物化學與分子生物學教研室, 遼寧 大連 116044)

腦組織代謝旺盛，血流量豐富，因此極易受到缺血缺氧的影響，引起神經細胞功能的損害[1]。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于腦部血液循環障礙，導致以局部神經功能損傷、缺失為特征的一組疾病[2]。該病死亡率高，并發癥和后遺癥多，嚴重危害人類健康，目前仍然缺乏有效的防治措施與理想藥物。

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人體內自有的活性物質，作為體內能量儲存和轉運的重要載體，為ATP補充能量，維持機體進行正常的活動和代謝[3]。PCr于1927年由Eggleton 于哺乳動物肌肉中分離得到，目前外源性PCr在臨床上主要作為心臟病的防治用藥之一廣泛用于心肌保護，但是其對腦損傷的保護作用以及機制研究鮮見報道。本文主要通過建立小鼠腦缺血與腦缺血再灌注模型以及建立大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞缺氧缺糖損傷模型來研究PCr對腦組織以及神經細胞的保護作用并進行相關機制的探討。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

PCr注射用無菌粉針劑，內含磷酸肌酸鈉1g/支，哈爾濱博萊制藥有限公司惠贈(批號070823，純度>97%)；肌酸由美國MERCK公司生產，純度≥99%。

Hyclone胎牛血清、高糖DMEM培養基、二甲基四氮唑藍(MTT)購自Gibco公司；Hyclone馬血清購自Thremo公司；連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)購自天津市化學試劑公司；LDH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；青霉素、鏈霉素購自大連制藥廠；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗對象與儀器

動物與細胞株：昆明種小鼠共120只，由大連醫科大學動物實驗中心提供；大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。儀器：3366型CO2培養箱，Thermo-354酶標儀，XD-101倒置顯微鏡，80-1型低速離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦缺血小鼠生存時間以及腦組織MDA含量的測定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機分為假手術組、模型組及藥物組。每組各20只。藥物組于造模前5 min緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)。麻醉后，頸部正中切口，分離兩側頸總動脈。藥物組及模型組雙重置線結扎兩側血管，假手術組只在血管下置線并不結扎。縫合皮膚切口，將小鼠置于37 ℃恒溫環境加以護理。觀察動物4 h內反應及死亡情況。

待小鼠瀕死時(小鼠呼吸<5 次/min視為瀕死)及手術后4 h記錄存活時間并在冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測。全部實驗結束后，在冰浴中用預冷的生理鹽水將腦組織配制成20%腦勻漿，4 ℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液進行MDA含量測定(硫代巴比妥酸比色法)。

1.3.2 腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的測定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機分為假手術組、模型組以及藥物組。每組20只。小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)，麻醉后，頸部正中切口，分離兩側頸總動脈。藥物組緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

給藥后8 min，藥物組及模型組分別夾閉兩側頸總動脈，假手術組不夾閉動脈。30 min后取下微型動脈夾，再灌注30 min后立即冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測。MDA測定方法同上。

1.3.3 PC12細胞缺氧缺糖損傷模型MTT和LDH含量測定：PC12細胞用高糖DMEM完全培養基(內含10%滅活胎牛血清、5%馬血清、青霉素/鏈霉素100 U/mL)置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。根據細胞生長情況， 2～3 d換培養液1次，待細胞80%匯合或接近匯合成片后，用0.05%胰蛋白酶消化并用吸管輕輕吹打收集細胞，每周傳代2次。

取對數生長期PC12細胞，消化離心后用完全培養基重懸，密度為2×105個/mL，接種于96 孔板上。在37 ℃, 5%CO2飽和濕度條件下培養24 h，使細胞完全貼壁后，棄去原培養液，用D-Hanks液輕輕蕩洗2次。

實驗分為正常組，缺氧缺糖模型組，藥物組(PCr組以及肌酸組)。正常組細胞用含糖Earle’s液 (g/L) (NaCl 6.68，KCl 0.04，CaCl20.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaHCO32.2，NaH2PO4·2H2O 0.4，HEPES 2.4，葡萄糖0.2，pH 7.4) 培養。模型組細胞用含4 mmol/L Na2S2O4的無糖Earle’s液(配置方法同上，但不加葡萄糖)進行培養(各損傷小組的Na2S2O4的濃度分別為0.5、1、2、4、8 mmol/L)。藥物組細胞用含4 mmol/L Na2S2O4以及不同濃度藥物的無糖Earle’s液進行培養，藥物終濃度分別為20、15、10、8、5、1 mmol/L。將培養板置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養3 h后回收上清液，并加無血清高糖DMEM液100 μL/孔，MTT(終濃度0.5 mg/mL) 10 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱內繼續培養4 h后，加入三聯液(10%SDS，5%異丙醇，0.012 mol/L HCl)100 μL/孔，待紫色結晶完全溶解后，于全自動酶標儀570 nm波長處測定A值。藥物抑制率=(A藥物組-A模型組) /(A正常組-A模型組) ×100%。用LDH試劑盒測定上清液中LDH的釋放量，測定方法依照LDH試劑盒說明書上操作，于440 nm處測定A值。LDH含量按公式計算：LDH (U/L)=(A測定-A測定空白) /(A標準-A標準空白) ×2000。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 PCr對腦缺血小鼠生存時間以及腦組織MDA含量的影響

藥物組小鼠與模型組小鼠相比存活時間明顯延長，腦組織MDA含量下降，其小鼠腦組織MDA水平與模型組相比差異具有顯著性意義，P<0.05。見表1。

2.2 PCr對腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

如表1所示，在缺血再灌注模型中，藥物組小鼠腦組織MDA含量下降，與模型組小鼠腦組織MDA的水平相比差異具有顯著性意義，P<0.05。

表1 PCr對腦缺血小鼠生存時間及對腦缺血/腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

2.3 PCr對PC12細胞缺氧缺糖損傷模型的影響

2.3.1 Na2S2O4致PC12細胞缺氧缺糖損傷作用

Na2S2O4濃度為 1、2、4及8 mmol/L時的損傷程度與正常組相比，差異有顯著性意義。見表2。細胞培養液中的Na2S2O4濃度達到4 mmol/L及以上時，MTT法測得的細胞存活率顯著降低，同時細胞培養上清液中的LDH 釋放量顯著上升，故確定4 mmol/L Na2S2O4為實驗所用的損傷濃度。

表2 不同濃度Na2S2O4對PC12細胞損傷作用的比較

2.3.2 PCr和肌酸對PC12細胞缺氧缺糖損傷的保護作用

由表3可見，與模型組比較，PCr和肌酸組隨藥物濃度的增加，Na2S2O4誘導的PC12細胞缺氧缺糖損傷有所減輕，細胞存活率明顯提高，受損細胞LDH的釋放受到抑制。從藥物終濃度為5 mmol/L開始，藥物組與模型組相比差異有顯著性意義。藥物終濃度至10 mmol/L時，對Na2S2O4誘導產生的缺氧缺糖損傷的保護作用達到高峰，繼續增加藥物濃度其保護作用沒有顯著增加。各濃度的PCr與相同濃度的陽性對照藥肌酸相比，差異無顯著性意義。

表3 PCr以及肌酸對缺氧缺糖細胞損傷模型的保護作用

3 討 論

能量代謝障礙是腦缺氧缺血后最早產生的病理生理改變，隨后產生大量自由基并引發一系列級聯反應，促使神經細胞趨向死亡[4]。腦組織缺氧缺血時能夠產生大量的氧自由基；此外，腦細胞神經元富含對氧自由基敏感的多不飽和脂肪酸而抗氧化的物質相對缺乏，因此極易受到自由基的侵襲傷害[5-6]，以上正是ICVD 的發病基礎。

興奮性毒素—谷氨酸的過度釋放是導致缺血缺氧性腦損傷的重要機制之一。由于谷氨酸是一種興奮性神經遞質，所以過量的情況下作用于NMDA受體和非NMDA受體，可引起細胞內鈣超載并激活鈣依賴的各種酶，損傷細胞結構；鈣超載又會生成大量的ROS，促進細胞膜的脂質過氧化，最終造成神經元退變壞死或遲發性死亡[7]。

PCr是人體中一種高能儲存物質，通過“肌酸穿梭”的機制來完成線粒體氧化磷酸化生成ATP，目前在國內外已被廣泛用做心臟病的防治用藥之一[8-11]。腦缺血后,能量衰竭主要表現在高能磷酸化合物ATP、PCr的耗竭上。在缺血缺氧初期，氧化磷酸化不能正常進行，ATP減少，糖無氧酵解的關鍵酶——磷酸果糖激酶會被激活，糖無氧酵解增加，能夠補充生成ATP，但是通過這種方式產生的ATP要遠遠少于氧化磷酸化所生成的ATP，因此最終還是會造成能量代謝紊亂，給組織細胞帶來損害。本研究證明在缺血缺氧時，內源性PCr不能滿足機體對ATP的需求。

在機體內，PCr主要由肌酸經肌酸激酶催化而來。 Balestrino M等[12]發現，肌酸能夠有效抑制去極化引起的大鼠腦組織的缺氧缺血損傷，由此可以推測，PCr可能對缺血缺氧的腦組織也具有保護作用。目前，已有一些醫護工作者將PCr試用于臨床的腦損傷患者，并取得了一些療效[13-14]。為了切實檢測PCr的腦保護作用，本研究復制了全腦缺血以及腦缺血再灌注小鼠實驗模型并進行了腦組織MDA含量的測定。MDA是自由基脂質過氧化作用的終產物，其含量高低可以反映脂質過氧化的水平，間接反映機體細胞受氧自由基損害的程度[15]。實驗結果表明，PCr能夠顯著延長全腦缺血小鼠的生存時間，并降低全腦缺血與腦缺血再灌注小鼠腦內的MDA含量，證明PCr能夠通過提高腦內ATP水平，增進缺血缺氧腦內的能量代謝進而阻止自由基的產生，保護腦細胞。

本研究利用Na2S2O4構建了缺氧缺糖PC12細胞損傷模型。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株，細胞膜上有NMDA受體、膽堿能M、N受體等，具有神經內分泌細胞的一般特征，該細胞純化程度高、生長繁殖快、培養周期短、使用方便、條件易控制并有可傳代性，所以可以代替神經細胞廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究[16-19]。

LDH是無氧代謝的標志性酶，廣泛存在于各組織的細胞漿內，正常情況下不能通過細胞膜，而當細胞受損或者死亡時，就能夠釋放到細胞外，細胞的受損程度與細胞培養上清液中的LDH活性成正比[20]。故測定培養液中LDH活性是反映細胞損傷的一種敏感且較為簡便快捷的指標。

本實驗采用MTT法檢測細胞的增殖和存活狀態，LDH活性來反映細胞的損傷程度。結果表明：Na2S2O4引起的PC12細胞缺氧缺糖損傷后細胞活力降低，細胞培養液中LDH含量增加，證明細胞破損嚴重。本研究發現PCr和肌酸均可顯著抑制PC12細胞缺氧缺糖的損傷情況,不同程度地提高受損PC12細胞的存活率并抑制LDH的釋放，并在一定范圍之內具有劑量依賴性。當藥物的濃度達到10 mmol/L時，其抑制率達高峰，在此之后即使繼續增大藥物濃度，細胞的MTT值不再增加，培養液上清中的LDH含量也不再明顯下降，說明此時藥物的保護作用已發揮到最大。因此，本實驗中藥物的最佳濃度為10 mmol/L，與以往國外的文獻報道一致[21-22]。本實驗結果顯示，肌酸的作用效果和PCr相近。由于肌酸是PCr的代謝產物，所以推測PCr的抗氧自由基作用可能與其可以代謝成肌酸有關。

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