高效液相色譜法快速測定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量*

吳學軍，金鵬飛，朱峰，鄒定，胡欣，孫春華

(1.衛生部北京醫院藥學部，100730;2.解放軍總參謀部警衛局衛生保健處，北京 100017)

氨基葡萄糖屬于天然氨基單糖，可以刺激軟骨細胞產生有正常多聚體結構的蛋白多糖，抑制損傷軟骨的酶(如膠原酶和磷脂酶A2等)，并可防止損傷細胞的超氧化自由基的產生，從而延緩骨性關節炎的病理過程和疾病進展，改善關節活動，緩解疼痛。鹽酸氨基葡萄糖膠囊是常見的氨基葡萄糖制劑，臨床上主要應用于骨關節炎的治療和預防。現行國家藥品標準WS1-(X-090)-2005Z采用Elson-Morgan反應后的紫外分光光度法測定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，操作甚為復雜，且反應程度受酸堿度、反應溫度、反應時間等因素的影響，結果不易控制。文獻對鹽酸氨基葡萄糖片劑含量測定方法的報道較多［1-3］，但對膠囊劑的報道甚少，有文獻［4-5］采用衍生化高效液相色譜法和衍生化氣相色譜法測定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，但操作也較為復雜。筆者在本實驗中建立的高效液相色譜法可直接測定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，具有快速、準確的特點。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Wasters 2695液相色譜分離系統(包括四元梯度泵、自動進樣器和柱溫箱)，Waters 2696二極管陣列檢測器和Empower?色譜工作站(美國，Waters公司);Mettler XP-205十萬分之一電子天平(瑞士，梅特勒公司);Milli-Q超純水處理系統(法國，Millipore公司)。KQ-800KDE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，101A-2型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器總廠)，SPX-250 IC微電腦人工氣候箱(上海博迅實業有限公司)。

1.2 試藥 乙腈(美國Fisher公司，色譜純)，磷酸二氫銨、磷酸、氨水、30%過氧化氫(分析純)。鹽酸氨基葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:649-200001)，鹽酸氨基葡萄糖膠囊(商品名:葡立?，山西中遠威藥業有限公司生產，規格:每粒0.24 g，批號:20100403，20100503，20100310)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:10 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液-乙腈(95∶5，V/V);流速:0.5 mL·min-1;進樣量:20 μL;檢測波長:194 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品約625 mg，置于50 mL量瓶中，加水適量，超聲使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，即為鹽酸氨基葡萄糖儲備液。精密量取鹽酸氨基葡萄糖儲備液適量，分別用水稀釋成濃度約為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg·mL-1鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液。以2.0 mg·mL-1的鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液為含量測定用對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取鹽酸氨基葡萄糖膠囊20粒，計算平均裝量，取內容物研細，精密稱取內容物粉末適量(相當于鹽酸氨基葡萄糖0.2 g)，置100 mL量瓶中，加水適量，超聲處理20 min，并用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 根據鹽酸氨基葡萄糖膠囊的制劑配方，配制不含鹽酸氨基葡萄糖的陰性對照粉末。精密稱取陰性對照粉末適量(相當于0.8粒輔料量)，按照“供試品溶液的制備”項下方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗

2.5.1 基質干擾實驗 分別取陰性對照溶液、鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示制劑輔料不干擾鹽酸氨基葡萄糖的測定，見圖1A-C。

2.5.2 強制降解實驗 為進一步考察方法的專屬性，對鹽酸氨基葡萄糖膠囊內容物分別在加熱、光照、氧化、酸化和堿化等條件下進行了強制降解實驗，以排除降解產物對鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的干擾。熱降解產物的考察:鹽酸氨基葡萄糖膠囊內容物適量(相當于鹽酸氨基葡萄糖0.2 g)，置于100 mL量瓶中，80℃烘箱加熱4 h，冷卻至室溫后，按照“供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，進樣分析。光降解產物的考察:上述內容物置于微電腦人工氣候箱中，10 000 Lx光照強度下照射4 h后，制備供試品溶液;氧化產物的考察:在上述內容物中加入30%過氧化氫溶液5 mL，暗處放置24 h后，制備供試品溶液;酸降解產物的考察:在上述內容物中加入20%磷酸溶液5 mL，暗處放置24 h后，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液中和成中性，制備供試品溶液;堿降解產物的考察:在上述內容物中加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，暗處放置24 h后，用20%磷酸溶液中和成中性，制備供試品溶液。強制降解試驗表明:加熱、光照和酸性條件下，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的峰面積未見降低;氧化條件下，峰面積有所降低，但未檢測到雜質峰;堿性條件下峰面積降低明顯，且能檢測到多個雜質峰，但雜質峰基本不干擾定量。見圖1D。

2.6 系統適應性、最低檢測限和線性關系考察 取對照品溶液連續進樣6次，考察鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的理論塔板數和對稱因子。其理論塔板數和對稱因子的平均值分別為7 077和1.33，RSD分別為1.80%和0.90%(n=6)。將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比(S/N)約為3.0時的濃度為最低檢測限;鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測限為0.04 mg·mL-1。以鹽酸氨基葡萄糖的質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標，在相當于供試品溶液濃度50% ～150%的范圍內進行了線性考察，線性方程為:Y=1 652 666X+265 616，r為0.999 5。

圖1 4種溶液的高效液相色譜圖A.陰性對照溶液;B.對照品溶液;C.供試品溶液;D.供試品堿降解;1.鹽酸氨基葡萄糖

2.7 精密度和穩定性實驗 對批號為20100503的樣品獨立制備6份供試品溶液，測得鹽酸氨基葡萄糖含量的RSD為0.59%(n=6)，表明方法重復性良好。1份供試品溶液連續進樣6次，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰峰面積的RSD為1.40%(n=6)，表明儀器精密度良好。批號為20100503的樣品，由不同的操作者，連續6 d制備供試品溶液，測得鹽酸氨基葡萄糖含量的RSD為0.76%(n=6)，表明方法中間精密度良好。對保存于室溫中的供試品溶液(批號為20100503)分別于0，1，2，4，8 h 進樣分析，測得峰面積的 RSD 為1.15%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.8 回收率實驗 在陰性對照粉末中分別加入適量的儲備液，按照“供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，在相當于供試品溶液75%，100%和125%的濃度水平下，分別考察加樣回收率。每個濃度制備3份，峰面積平均值和對照品溶液峰面積平均值的比值作為回收率。測得3個濃度下的回收率分別為98.9%，100.9%和100.3%，RSD分別為0.81%，0.91%和0.60%(n=3)。

2.9 樣品測定 取批號為 20100403，20100503，20100310的鹽酸氨基葡萄糖膠囊樣品，按照“供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，每批樣品制備3份，按上述色譜條件進樣分析;按外標法計算鹽酸氨基葡萄糖的含量。測得鹽酸氨基葡萄糖的平均含量分別為 100.0%，101.6%和98.8%，RSD分別為1.37%，1.90%和0.68%(n=3)。

2.10 方法學比較 為進一步對方法學進行驗證，筆者還采用現行國家藥品標準WS1-(X-090)-2005Z對批號為20100403，20100503，20100310的鹽酸氨基葡萄糖膠囊樣品進行了測定，每批樣品制備3份，測得平均含量分別為101.3%，100.4%和98.7%，RSD分別為0.07%，0.17%和0.17%(n=3)。其測定結果和本法測定結果具有良好的一致性。

3 討論

目前，《美國藥典》雖未收載鹽酸氨基葡萄糖膠囊劑，但收載了原料藥和片劑，所用方法即為無需衍生化的高效液相色譜法，色譜柱:C8柱，流動相:0.05%磷酸溶液(氫氧化鉀調至 pH 3.0)-乙腈(60∶40，V/V)，檢測波長:195 nm。但將《美國藥典》方法運用于鹽酸氨基葡萄糖膠囊劑的測定時，發現以下幾個問題:①鹽酸氨基葡萄糖色譜峰(tR=3.21 min)和堿降解產物的色譜峰幾乎完全重合，無法分辨;②峰形不佳，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰對稱因子＞1.5，理論塔板數＜2 500;③鹽酸氨基葡萄糖色譜峰和SO2-4、CO2-3、NO2-3色譜峰的分離度＜1.5。而本方法系統適應性參數優于《美國藥典》方法，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰和SO2-4、CO2-3、NO2-3色譜峰的分離度均＞1.5，和堿降解產物色譜峰的分離度也達到1.3。

筆者在本實驗中對磷酸二氫銨溶液的濃度和pH也進行了優化，結果發現加大濃度并不能改善分離度，反而會在鹽酸氨基葡萄糖色譜峰前面出現明顯的倒峰;降低pH會抑制色譜峰的強度，升高則峰形變差，反而是不調節最佳。

［1］ 洪專，黃宏南，許晨，等.HPLC-ELSD測定氨基葡萄糖含量［J］.中國衛生檢驗雜志，2007，17(6):1025-1026.

［2］ 任連杰，山廣志，李群，等.積分脈沖安培檢測-高效陰離子交換色譜法測定鹽酸氨基葡萄糖口腔崩解片含量［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(5):323-325.

［3］ 王英瑛，李俊，曾蘇.氨基葡萄糖3種含量測定方法的比較［J］.中國現代應用藥學雜志，2009，26(4):307-309.

［4］ 李俊，王英瑛.衍生化氣相色譜法測定氨基葡萄糖制劑含量［J］.醫藥導報，2009，28(3):359-361.

［5］ 王英瑛，李俊，曾蘇.反相高效液相色譜衍生化法測定氨基葡萄糖原料及其制劑的含量［J］.醫藥導報，2008，27(7):851-852.