四黃軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

黃毅，彭東洲，鄭維思，孫立敏，云玉瓊，譚紅，朱昊宇

(廣東省珠海市慢性病防治站，519000)

四黃軟膏是我站研制的外用軟膏，由黃芩、黃柏、大黃、硫磺等藥材組成，具有清熱燥濕、瀉火解毒、除濕止癢等作用，臨床上用于治療陰囊濕疹、慢性皮炎、毛囊炎等癥。為更好地控制該制劑質(zhì)量，確保臨床使用安全有效，筆者對(duì)方中黃柏和大黃進(jìn)行了薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定了制劑中黃芩苷的含量。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀，島津SPD-20A紫外檢測(cè)器，Sartorius BS分析天平(d=0.1 mg)，C5860A型超聲波清洗器(超聲頻率:40 kHz，超聲功率:180 W)，ZF-20型紫外線分析儀，層析用硅膠(青島海洋化工廠)。黃柏對(duì)照藥材(批號(hào):121510-200703)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào):120984-200602)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):110715-200815)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，四黃軟膏(本站提供，批號(hào):20091208，20090914，20090728)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏的TLC鑒別 取本品0.5 g，加無(wú)水乙醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為供試品溶液;取黃柏對(duì)照藥材0.06 g，加無(wú)水乙醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對(duì)照藥材溶液;取陰性樣品(處方各味藥材，去黃柏，按四黃軟膏制備工藝制成)，同法制成陰性對(duì)照溶液;照TLC法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)12 cm(展開(kāi)溫度20℃，相對(duì)濕度65%)，取出，晾干，置紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視(圖1)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)(Rf分別為0.41和0.48)，而陰性對(duì)照色譜在相應(yīng)的位置上無(wú)干擾。

2.2 大黃的TLC鑒別 取本品6 g，加水2 mL攪拌使分散均勻，加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，加水20 mL、鹽酸2 mL溶解，水浴回流30 min，冷卻，用乙醚分2次振搖提取，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液;取陰性樣品(處方各味藥材，去大黃，按四黃軟膏制備工藝制成)，同法制成陰性對(duì)照溶液;取大黃對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照TLC法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)12 cm(展開(kāi)溫度20℃，相對(duì)濕度65%)，取出，晾干。置于365 nm波長(zhǎng)紫外燈下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)(Rf分別為0.40和0.57)，置氨氣中熏蒸后，顏色變深，而陰性對(duì)照品色譜在相應(yīng)的位置上無(wú)干擾。

圖1 4種溶液的TLC圖譜1.黃柏對(duì)照藥材;2.陰性對(duì)照;3，4.樣品(批號(hào):20091208)

圖2 6種溶液的TLC圖譜1，2.樣品;3，4.大黃對(duì)照藥材;5，6.陰性對(duì)照

2.3 黃芩苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇∶1%冰醋酸(60∶40);流速:1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇制成每毫升約含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品(批號(hào):20091208)0.5 g，精密稱(chēng)定，置于10 mL燒杯中，加入水2.5 mL，50～60℃水浴中溫?zé)崾蛊浞稚ⅲ爬洌D(zhuǎn)移至25 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，高速離心，取上清液，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方量的除黃芩以外的各組分，按四黃軟膏制備工藝制成陰性樣品，再按“2.3.3”項(xiàng)方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取上述對(duì)照品、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，照“2.3.1”項(xiàng)色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算為2 533;待測(cè)峰與其他組分峰分離度良好，拖尾因子及分離度分別為1.03和2.69，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版要求，陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.3.6 線性范圍考察 取黃芩苷對(duì)照品約10.0 mg，精密稱(chēng)定，置于100 mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取該溶液6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;分別進(jìn)樣 1，5，10，15，20 μL，記錄色譜圖，以對(duì)照品的量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=4E+06X-72 754，r=0.999 8，結(jié)果黃芩苷在0.06～1.20 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取軟膏(批號(hào):20091208，黃芩苷含量2.55 mg·g-1)0.25 g，共9份，置于10 mL燒杯，精密稱(chēng)定，加水2.5 mL，在50～60℃加熱輕搖使分散均勻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，用甲醇分次洗滌容器，洗液轉(zhuǎn)入同一量瓶中，分別加入對(duì)照品使測(cè)定濃度分別達(dá)到待測(cè)樣品濃度的80%，100%和120%，加甲醇至刻度，搖勻，高速離心，取上清液，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率100.96%，RSD=1.89%。

圖3 3種溶液的高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照品;B.黃芩苷對(duì)照品;C.供試品;1黃芩苷

表1 四黃軟膏中黃苓苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg，n=6

2.3.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次依測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，記錄黃芩苷色譜峰面積，結(jié)果RSD為0.55%。

2.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào):20091208)，按“2.3.3”項(xiàng)方法平行制備6份，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果黃芩苷的平均含量為2.55 mg·g-1，RSD=1.10% 。

2.3.10 供試液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)同一份供試品溶液，室溫放置，分別連續(xù)6 d測(cè)定黃芩苷的峰面積，結(jié)果表明，峰面積變化不大，RSD為0.68%，說(shuō)明樣品在6 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.11 3批樣品的含量測(cè)定 取3批四黃軟膏 (批號(hào):20090728，20090914，20091208)，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算。結(jié)果3批樣品中黃芩苷含量分別為 2.41，2.65，2.55 mg·g-1。

3 討論

3.1 TLC展開(kāi)劑 本實(shí)驗(yàn)中黃柏、大黃鑒別中所采用的TLC展開(kāi)劑分別參見(jiàn)2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》平肝舒絡(luò)丸及狼瘡?fù)梃b別項(xiàng)下的相關(guān)條件。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)選 《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版收載的測(cè)定中成藥(丸劑、片劑或顆粒劑)中黃芩苷時(shí)，采用的溶劑有50%甲醇、70%乙醇或稀乙醇等;提取方法常采用回流或超聲的方法。筆者在本研究中考察了不同溶劑、不同提取方法以及不同提取時(shí)間對(duì)黃芩苷的提取情況，發(fā)現(xiàn)軟膏輔料及制劑中硫磺對(duì)黃芩苷的提取有較大的影響。

3.2.1 提取溶劑的優(yōu)選 筆者考察了甲醇、甲醇-水(60∶40)和50%甲醇3種溶劑，經(jīng)超聲、回流相同時(shí)間后，測(cè)定黃芩苷峰面積，依次1 815 242，1 806 010和1 572 742，表明以甲醇或甲醇∶水(60∶40)作為提取溶劑均較好。

3.2.2 提取方法的優(yōu)選 筆者曾以甲醇為溶劑，考察采用直接超聲提取法、水浴回流提取法以及先用少量水分散再超聲提取法對(duì)黃芩苷的提取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:加入甲醇后振搖，樣品保持團(tuán)塊狀不易分散;另外可能因本品中含有硫磺，不論是加熱還是超聲，都易引起樣品聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，影響測(cè)定，且需60 min以上超聲或回流后才能提取完全;如果利用軟膏劑中含有較多的表面活性劑，加入少量水略微加熱一下，樣品就很容易分散，加入甲醇后仍能保持較好的分散狀態(tài)，此時(shí)以及繼續(xù)分別超聲處理10，20和30 min的樣品，峰面積基本相同，同時(shí)也與回流1 h以上的峰面積一致，說(shuō)明采用先用少量水分散再加入甲醇混勻后的樣品，即使不超聲黃芩苷也能較好的提取出來(lái)，且操作起來(lái)簡(jiǎn)便，快速。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)選 參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》雙黃連片含量測(cè)定項(xiàng)下所用流動(dòng)相(有機(jī)相為甲醇，水相為2%醋酸)，并對(duì)水相和有機(jī)相的比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，考察其對(duì)樣品分離度的影響，結(jié)果在水相從45%增加至55%，黃芩苷和相鄰峰均不能得到很好的分離，當(dāng)增至60%時(shí)，雖然可與相鄰峰分開(kāi)，但峰形不對(duì)稱(chēng)。調(diào)節(jié)水相為1%冰醋酸，并考察不同比例水相和有機(jī)相對(duì)樣品分離情況的影響，結(jié)果分離度及峰形均明顯改善，分離度達(dá)到要求，且峰形對(duì)稱(chēng)。最終確定流動(dòng)相為甲醇∶1%醋酸(60∶40)。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》雙黃連片和芩暴紅止咳片黃芩苷含量測(cè)定項(xiàng)下所用波長(zhǎng)，其流動(dòng)相組成相近。

盡管在《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版及一些文獻(xiàn)中收載了黃芩苷的含量測(cè)定法，但有關(guān)在軟膏劑中的含量測(cè)定的方法報(bào)道較少。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，由于軟膏中含有大量的油相、表面活性劑和水，以及本制劑中含有的硫磺，對(duì)黃芩苷的提取影響較大，如果采用常用固體制劑的樣品處理方法，難以收到理想的效果。筆者在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)四黃軟膏的特點(diǎn)，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，方法簡(jiǎn)便易行，對(duì)其他軟膏劑的樣品處理有一定的借鑒作用。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:554，566，612，638，737.

［2］ 陳毅新，劉杜妙.四黃正骨水的薄層色譜鑒別及微生物限度檢查［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18(12):45-46.

［3］ 楊立偉，龍飛，肖樹(shù)雄.HPLC法測(cè)定消炎清熱膠囊中黃芩苷的含量［J］.中國(guó)藥房，2008，19(21):1632-1634.