神農香菊全草特征指紋圖譜研究

詹曉蓮，盧金清

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科，武漢 430022;2.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430061)

神農香菊全草為菊科植物神農香菊［Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H．Liu et S.F.Zhang］的全草［1］。神農香菊藥用部位為其干燥頭狀花序，該藥具有疏風清熱、平肝明目、散風降壓的功效［2］，主要化學成分為黃酮類化合物［3］。筆者未見神農香菊全草化學成分特征圖譜研究的文獻。近年來，隨著神農香菊的不斷開發，需求量急劇增加，導致采挖神農香菊現象嚴重，野生資源遭到嚴重破壞。神農香菊人工種植又面臨生長條件要求高，不能在平原地區大面積種植等困難。為了擴大神農香菊的藥用部位，提高其藥用價值，筆者對神農香菊全草部位的指紋圖譜等進行了較系統的研究，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法建立了神農香菊全草的特征圖譜。經過系統適用性實驗和方法學考察，發現神農香菊全草的特征圖譜具有系統性、全面性和特征性，可以有效地鑒別神農香菊全草及其原藥材，為全面評價和控制神農香菊的質量提供了科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex-Ultimate 3000液相色譜儀，Starsorius BSI型電子分析天平(d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司)，UP520H超聲波清洗機(熊貓集團南京電子計量有限公司)，Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 試藥 甲醇為色譜純(美國天地公司，批號:100019-200703)，磷酸(上海振興化工一廠，分析醇，批號:112041-200611)，磷酸二氫鉀(上海實驗試劑有限公司，批號:100745-200701)，水為雙蒸水，木犀草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111520-200201)，神農香菊［由湖北中醫藥大學中藥鑒定教研室陳科力教授鑒定為Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H.Liu et S.F.Zhang，共 10 個樣品，見表1］。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.5)為流動相A，以甲醇為流動相B，按表2進行梯度洗脫;流速:0.5 mL·min-1;檢測波長 350 nm;柱溫:35℃，理論塔板數按木犀草素峰計算應不低于3 000。

表1 不同來源的神農香菊全草樣品

表2 流動相梯度洗脫表

2.2 試液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對照品適量，加甲醇制成每毫升含1.0 mg的溶液，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 本品粉末過篩孔內徑840 μm 篩(二號篩)，取1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，過濾，濾液置蒸發皿中蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察及相似度計算

2.3.1 精密度實驗 精密吸取1號供試品溶液5 μL，按上述色譜條件，連續進樣5次，以木犀草素峰(峰7)作為參照峰，指定其α值為1.000，考察儀器精密度，各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值分別在0.3%～1.0%和1.1%～2.8%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2 穩定性實驗 取3號供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0，3，6，9，12，24 h 進行檢測，以木犀草素峰為參照，指定其α值為1.000，考察供試品溶液的穩定性，各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值分別在0.2%～0.9%和1.1%～2.8%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.3.3 重復性研究 取本品5號粉末［過篩孔內徑為(850±29)μm 篩］5份，每份1.0 g，精密稱定，照“供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，以木犀草素峰為參照，指定其α值為1.000，考察方法的重復性，各特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的RSD值分別在0.2% ～0.9%和1.3% ～2.9%之間，均＜3%，符合指紋圖譜的要求。

2.4 指紋圖譜及技術參數 取樣品粉末［過篩孔內徑(850±29)μm］10批，每份1.0 g，照“供試品溶液的制備”項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定。選定木犀草素峰作為參照，指定的α值為1.000，特征指紋峰相對保留時間和特征指紋峰相對峰面積的結果見表3，4。

表3 神農香菊全草共有特征指紋峰相對保留時間

表4 神農香菊全草共有特征指紋相對峰峰面積

通過對10批神農香菊藥材全草指紋圖譜的HPLC-FPS和不同樣品間HPLC-FPS的比較，建立神農香菊藥材對照指紋圖譜，各樣品指紋圖譜特征峰與對照指紋圖譜特征峰有良好的重復性，神農香菊全草指紋圖譜應有10個特征峰。見圖1。

圖1 神農香菊全草對照藥材指紋圖譜7.木犀草素

2.5 相似度計算 根據國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2004A版，筆者計算了神農香菊10批藥材全草的相似度，結果分別為0.972，0.987，0.965，0.972，0.957，0.966，0.979，0.986，0.952，0.990。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 經實驗研究，選擇用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，曾使用過 Diamasil(200 mm ×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0mm，5 μm)、TURNER KromasilTM(4.6 mm×250 mm，5 μm)及 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根據色譜峰的分離效果及穩定性等因素綜合考慮，選擇使用 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

3.2 流動相的選擇 筆者曾使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸作為流動相進行等度及梯度洗脫，結果木犀草素的色譜峰對稱性差且各色譜峰分離度不好，最后根據分離情況和色譜峰的對稱性選擇以磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.5)為流動相A，以甲醇為流動相B，進行梯度洗脫效果最佳。

3.3 10批藥材全草指紋圖譜相似度評價 10批不同產地神農香菊全草樣品的指紋圖譜面貌基本一致，由各產地神農香菊全草指紋圖譜相似度良好(r＞0.90)，反映了藥材的同源性，可以用來作定性鑒別。

本方法穩定、可靠、重復性好，可為神農香菊全草及其制劑質量標準的擬定提供參考依據，為神農香菊物質基礎研究與應用提供科學依據。可以有效地鑒別神農香菊，并評價其質量，完善了神農香菊的質量評價體系，有利于其進一步的開發利用。

［1］ 劉啟宏，張樹藩.神農架菊屬一新變種［J］.武漢植物研究，1983，1(2):237.

［2］ 李志浩，李鵬，朱雪松，等.反相高效液相色譜法同時測定神農香菊中綠原酸木犀草素和蒙花苷的含量［J］.醫藥導報，2010，29(4):527-529.

［3］ 襲復俊，王國亮，袁曉，等.神農香菊花的化學成分研究(Ⅱ)［J］.武漢植物研究，2005，23(6):610-612.