辛伐他汀對冠心病患者主動脈MMP-2和MMP-9的影響

馮增斌 劉志偉 肖 鋒 胡建功 房大廣

(承德醫學院附屬醫院心臟外科，河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化不穩定斑塊破裂是急性冠脈綜合征發生的主要原因。基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的MMP-2、MMP-9可導致斑塊纖維帽基質的降解使得斑塊易于破裂而導致急性冠脈綜合征的發生〔1〕。辛伐他汀可降低大鼠、家兔主動脈組織內MMP-2，MMP-9的含量及表達〔2〕，對于人類臨床研究文獻較少。本試驗旨在研究冠心病行冠狀動脈移植術患者應用辛伐他汀后主動脈組織及血清內MMP-2、MMP-9含量的變化，探討藥物干預的可能機制，給臨床用藥提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 我院自2007年2月至2009年9月行冠狀動脈旁路移植術患者46例，均行冠脈造影檢查證實有三支冠狀動脈狹窄或左主干病變，具備手術指征。近期無發熱、感染、合并免疫性疾病、腫瘤及肝、腎功能異常。術前全部服用硝酸異山梨醇酯、貝他樂克、阿司匹林等藥物，并皮下注射低分子肝素。其中27例服用辛伐他汀4 w以上，20 mg/d，睡前服用，此組為治療組。另有19例患者未進行降脂治療，未服用過他汀類藥物，為對照組。治療組男16例、女11例，年齡46～68〔平均(56±9)〕歲，10例有心肌梗死病史，5例合并室壁瘤，15例血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、載脂蛋白B(ApoB)全部正常，12例有不同程度升高。對照組男13例、女6例，年齡50～65〔平均(57±5)〕歲，均無心肌梗死病史及室壁瘤，查血脂5例全部正常，14例有不同程度升高。

1.2 試劑 辛伐他汀(商品名舒降之)由杭州默沙東公司提供。MMP-2，MMP-9試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司的雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒。MMP-2，MMP-9鼠抗人單克隆抗體購于武漢博士德公司。

1.3 標本采集 兩組患者經禁食12 h后，分別于術前經置入的頸靜脈插管抽取靜脈血4 ml，置于干燥玻璃試管中，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離血清，統一編號，－70℃冰箱保存。術中除乳內動脈與前降支吻合，其余血管橋均使用大隱靜脈。兩組患者采用靜脈橋(1.8±0.5)支。選擇升主動脈前壁打孔并與靜脈橋近端吻合。留取打孔器圓刃切下的主動脈組織石蠟包埋。

1.4 血清MMP-2、MMP-9的測定 采用酶聯免疫法(ELISA)測定。抗人多克隆抗體MMP-2(一抗)預先包被于酶標板上，分別加入標準液和待測血清樣本。MMP-2與一抗特異性結合。加入生物素化的抗人MMP-2(二抗)，與在單抗上的人MMP-2結合而形成免疫復合物，未結合的被洗去。辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與二抗的生物素結合，多余的物質被洗掉。加入四甲基聯苯胺(TMB)染色。最后加入終止液。置酶標分析儀中測量OD值。MMP-9測定同上。

1.5 主動脈組織MMP-2、MMP-9表達的測定 用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶(SABC)法染色。以胞漿或胞膜呈均一棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒者為陰性。方法及試劑:石蠟標本4μm連續切片，脫蠟至水。免疫組織化學染色按說明書指示進行;H2O2室溫滅活過氧化物酶，胰蛋白酶消化，檸檬酸微波修復。正常羊血清室溫封閉非特異抗原位點，滴加一抗(鼠抗人MMP-2單克隆抗體1∶50，鼠抗人MMP-9單克隆抗體1∶50)，37℃孵育2 h，滴加 SABC 復合物(1∶200)37℃ 20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)染色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。

1.6 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，數據用x±s表示，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。

2 結果

辛伐他汀組患者血清內MMP-2、MMP-9的含量明顯低于對照組(P＜0.01)。辛伐他汀組患者主動脈組織MMP-2〔10(27.0%)vs 11(57.9%)〕、MMP-9〔8(29.6%)vs 13(68.4%)〕的陽性表達明顯低于對照組(P＜0.01)。見表1，圖1，圖 2。

表1 兩組患者血清內MMP-2、MMP-9的含量(x±s)

圖1 主動脈組織MMP-2表達(×200)

圖2 主動脈組織MMP-9表達(×200)

3 討論

MMPs家族成員有20多種，其中MMP-2，MMP-9是血管壁細胞表達和分泌的最主要的MMP，在內膜損傷和粥樣病變形成的過程中起關鍵作用。故有作者認為血清MMPs水平能反映動脈硬化的病變程度〔3〕。動物試驗證實，MMP-2，MMP-9在高膽固醇兔動脈損傷的早期即有表達，在不穩定斑塊中顯著表達〔4〕。在炎性因子啟動下，粥樣斑塊內高濃度浸潤的巨噬細胞可釋放大量MMPs。Brown〔1〕等對冠心病患者經介入治療，旋切下的動脈粥樣硬化斑塊的MMP-2，MMP-9檢測表明，不穩定心絞痛患者其表達水平顯著高于穩定心絞痛患者。

近年許多關于他汀類藥物的臨床試驗結果表明，該類藥物可以明顯減緩冠心病患者動脈硬化病變的進展，且具有獨立其降脂作用外的穩定斑塊的作用，他汀類藥物能夠降低急性冠脈綜合征患者血清MMPs水平。2000年，Ikeda〔5〕等報道氟伐他汀能夠抑制人血管內皮細胞的MMP-1表達。這些研究均從他汀類藥物對細胞的直接作用觀察該類藥物對細胞MMPs表達的影響，并得出較肯定的結論。他汀類藥物抑制MMPs表達的機制尚不清楚，根據Yang等〔6〕的研究，可能與細胞外MMPs引導物(EMMPRN)有關。EMMPRN在人類單核/巨噬細胞中表達，并通過非膽固醇依賴的轉錄因子調節，在MMPs合成前48 h的活性作用達到高峰。EMMPRN在MMPs的合成中起著重要作用，他汀類藥物則可通過抑制EMMPRN轉錄因子從而抑制EMMPRN的基因表達，導致MMPs的合成受到抑制。

本試驗結果提示辛伐他汀通過減少主動脈組織MMP-2，MMP-9的表達，從而減少細胞外基質成分降解，減輕血管損傷，延緩動脈粥樣硬化病變，減少急性心血管事件。提示降低MMP-2，MMP-9表達水平可能是辛伐他汀抗動脈粥樣硬化機制之一。

1 Brown DL，Desai KK，Vakili BA，et al.Clinical and biochemical results of the metalloproteinase inhibition with subantimicrobial doses of doxycycline to prevent acute coronary syndromes(MIDAS)pilot trial〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(4):733-8.

2 Loftus IM，Thompson MM.The role of matrix metalloproteinases in vascular disease〔J〕.Vasc Med，2002;7(2):117-33.

3 Huang CY，Wu TC，Lin WT，et al.Effects of simvastatin withdrawal on serum matrix metalloproteinases in hypercholesterolaemic patients〔J〕.Eur J Clin Invest，2006;36(2):76-84.

4 Freestone T，Turner RJ，Higman DJ，et al.Influence of hypercholesterolemia and adventitial inflammation on the development of aortic aneurysm in rabbits〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(1):10-7.

5 Ikeda U，Shimpo M，Ohki R，et al.Fluvastatin inhibits matrix metalloproteinase-1 expression in human vascular endothelial cells〔J〕.Hypertension，2000;36(3):325-9.

6 Yang JM，Xu Z，Wu H，et al.Overexpression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2003;1(6):420-7.