芝麻素對大鼠非酒精性脂肪肝的預防作用

代 利 李繡花 趙新平 董小霞 倪淑華

(山西醫科大學公共學院營養與食品衛生教研室，山西 太原 030001)

目前，臨床一線的調脂藥物以他汀類及貝特類為主，但因需長期應用，或者聯合用藥，其肝臟損害的副作用常常成為限制其臨床應用的重要原因〔1〕。芝麻作為常用的油料作物，其營養價值已經得到公認〔2，3〕。其主要活性成分芝麻素具有降低膽固醇、抗氧化、降血壓等作用〔4〕。汪五三等〔5〕研究發現，芝麻素對撲熱息痛、酒精、四氯化碳所致的肝損傷有一定的保護作用，對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用如何研究報道較少。本研究探討芝麻素對大鼠NAFLD的防治作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 飼料配制、動物分組及喂養 基礎飼料由山西醫科大學醫學院動物實驗中心提供，高脂飼料按1%膽固醇、5%豬油、0.25%膽酸鹽、93.75%基礎飼料的比例配。由山西醫科大學實驗動物中心提供清潔級SD雄性大鼠，體重90～110 g，經基礎飼料適應性喂養3 d后，測體重及血清總膽固醇(TC)，按體重及血清TC水平將動物隨機分為普通對照組、高脂模型組、芝麻素低、中、高劑量組，每組8只動物。大鼠單籠喂養，自由攝食及飲水，每周測量1次體重及攝食量，觀察記錄動物生長與進食情況。動物室溫度控制在22℃，相對濕度65% ～70%，實驗期9 w。實驗期間，正常對照組給予基礎飼料，其余各組喂飼高脂飼料，芝麻素低、中、高劑量組分別給予芝麻素混懸液20、40、80 mg·kg－1·d－1灌胃。

1.2 標本采集與制備 實驗9 w結束，處死大鼠取出肝臟并稱重，部分肝臟用生理鹽水漂洗數次后，濾紙拭干;稱取1 g剪碎，加冰生理鹽水至總體積為10 ml。用玻璃勻漿器在冰水中進行碾磨勻漿，制成10%勻漿。4 000 r/min、4℃離心3 min，取上清，測定相關指標。另取部分肝右葉，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，作肝臟病理組織學檢查。

1.3 生化指標 用酶比色法測定肝勻漿TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供 。用硫代巴比妥酸(TBA)法測丙二醛(MDA)、用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)，試劑盒均由南京建成生物研究所提供。以上指標嚴格按照試劑盒操作步驟測定。

1.4 分子生物學指標 RT-PCR方法檢測肝組織CYP2E1 mRNA表達:①按Trizol試劑盒說明從大鼠肝臟中提取總RNA;②成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄合成cDNA第一鏈;;③PCR擴增:引物及內參序列，見表1。CYP2E1擴增條件為94℃預變性3 min;94℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s;30個循環，72℃ 8 min。取PCR產物約4μl，以1%瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，紫外燈下觀察目的條帶。凝膠成像分析系統成像后測定目的條帶的積分光密度值，計算出目的基因與內參兩者的積分光密度比，即為各基因表達的相對量。

1.5 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行處理，數據以x±s表示，多組計量資料用單因素方差分析，用LST統計學方法進行多組間的兩兩比較。

表1 CYP2E1及內參(GADPH)核酸序列

2 結果

2.1 芝麻素對大鼠的體重和肝指數的影響 實驗結束時，各組動物體重無統計學差異。高脂模型組與正常對照組相比肝指數升高(P＜0.05);芝麻素各劑量組與高脂模型組相比，肝指數均下降(P＜0.05);但芝麻素各劑量組之間無統計學差異。見表2。

2.2 肝臟病理變化 大體形態觀察:正常組大鼠肝臟顏色鮮紅，質地柔軟，富有彈性;模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，觸之有油膩感，邊緣飽滿，質地稍韌;芝麻素各組大鼠肝臟體積較模型組略小，顏色呈較淺淡的黃褐色，質地、彈性和柔韌性較模型組略好。病理切片觀察:正常對照組肝小葉結構完整、清晰，中央靜脈大而壁薄，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀排列;模型組大鼠肝組織見重度脂肪變(即脂肪變性的肝細胞占肝小葉2/3以上)，肝細胞體積增大，排列紊亂，索狀結構不清，細胞內充滿以大空泡為主的混合性空泡，部分伴肝細胞水樣變，細胞核被擠向包膜;各實驗組肝細胞脂肪變性程度明顯減輕，表現為脂肪變性，肝細胞數目明顯減少，胞漿內脂滴減少或消失，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，無細胞壞死及炎細胞浸潤，說明各干預因素均可以明顯減輕肝脂肪變性的程度。見圖1。

圖1 各組肝臟病理組織觀察(HE，×400)

2.3 芝麻素對大鼠肝脂的影響 高脂模型組較正常對照組TC、TG、LDL-C均升高(P＜0.05);芝麻素三個劑量組較高脂模型組TC、TG、LDL-C均下降(P＜0.05)。隨芝麻素劑量增加TC、TG、LDL-C含量逐漸下降(P＜0.05)。見表3。

2.4 芝麻素對大鼠SOD、MDA的影響 高脂模型組較正常對照組SOD活力有所下降(P＜0.01)，芝麻素各劑量組SOD活力較高脂模型組均升高(P＜0.01)，且隨芝麻素劑量增加SOD活力增加。高脂模型組較正常對照組MDA高(P＜0.01);芝麻素各劑量組MDA含量均低于高脂模型組(P＜0.01)，與正常對照組無差異，芝麻素各劑量組間也無差異。見表4。

表2 芝麻素對大鼠體重及肝指數的影響(x ± s，n=8)

表3 芝麻素對大鼠肝勻漿TC、TG和LDL的影響(mmol/L，x ± s，n=8)

2.5 芝麻素對CYP2E1 mRNA表達的影響 與正常對照組相比(0.846±0.026)，高脂模型組CYP2E1 mRNA表達水平顯著增加(1.535±0.084，P＜0.05)，高、中、低劑量芝麻素各組CYP2E1 mRNA表達水平明顯低于高脂模型組(0.801±0.017，0.795±0.016，0.881±0.046，P ＜0.05)。見圖2。

表4 芝麻素對大鼠肝勻漿SOD、MDA的影響(x ± s，n=8)

圖2 RT-PCR檢測CYP2E1及GAPDH的表達

3 討論

脂肪肝的發病機制比較復雜，至今尚未完全闡明。Day等〔3〕提出的“二次打擊”學說在目前學術界得到較為普遍的認可。該學說認為初次打擊主要為高脂飲食，胰島素抵抗、瘦素抵抗等原因引起的肝臟脂肪代謝障礙。肝細胞脂肪變性是肝細胞對代謝障礙的適應性改變，同時也使肝細胞活性下降，對損傷的敏感性增加，且肝細胞內脂質的蓄積為氧應激脂質過氧化提供了足夠的反應基質;二次打擊是以氧應激脂質過氧化為主，活性氧大量生成，脂質過氧化伴細胞因子的活化，進而引起脂肪變性的肝細胞發生炎癥、壞死、甚至纖維化。因此，兼有調脂和抗氧化雙重作用的物質會更有利于脂肪肝的防治。

CYP450酶系在脂肪酸、TC的生物轉化中起重要作用。既往關于它們與脂肪肝關系的研究較少，且結論不盡一致。研究表明CYP2E1在酒精性肝病的發病機制中主要參與脂質過氧化反應〔6，7〕，在 NAFLD 中也起重要作用〔8〕。動物實驗表明，高脂飲食能使大鼠CYP2E1的活性顯著升高，并能在轉錄前水平誘導CYP2E1 mRNA水平和蛋白表達增強〔9〕。但Wagner等發現CYP2E1的表達在高脂情況下并沒有明顯增強〔10〕。

本試驗成功建立了NAFLD模型，并在高脂膳食的同時應用芝麻素進行干預。結果顯示，芝麻素能降低肝組織中的脂質水平及肝指數，減少脂肪酸的生成，緩解脂代謝紊亂，改善脂肪肝損傷;同時，本研究中各實驗組肝組織MDA低于模型對照組、SOD活力高于模型對照組，說明芝麻素通過減少脂質過氧化及發揮抗氧化作用抑制了脂質過氧化損傷，從而使肝臟免受損害。本研究高脂模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達顯著升高，說明CYP2E1 mRNA的增加使肝自由基產生增多，促進脂肪肝病變的進展。芝麻素能降低肝組織CYP2E1 mRNA的表達，提示芝麻素能有效減輕氧應激和脂質過氧化反應，增強肝內脂肪酸氧化，保護肝細胞。

綜上所述，芝麻素能降低脂肪肝大鼠肝中脂質的含量，阻礙了初次打擊對脂肪肝形成的作用;同時能顯著增加SOD活性，抑制氧化代謝產物MDA含量，顯著降低CYP2E1 mRNA的表達，因而能從提高機體抗氧化的能力，阻斷第二次打擊對肝細胞脂肪病變的進展。因而對NAFLD有一定的預防作用。

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3 Suja KP，Jayalekshmy A，Arumughan C.Free radical scavenging behavior of a ntioxidant compounds of sesame(sesamumindicum L)in DPPH system〔J〕.JAgric Food Chem，2004;52(4):912-5.

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5 汪五三，宋建國.芝麻素保肝作用實驗研究〔J〕.中藥藥理與臨床，2006;22(3、4):27-2.

6 林 青，李立紀，曹 東.抗脂肪肝研究的思考〔J〕.云南中醫學院學報，2002;25(1):41-2.

7 Day CY，Jmaes OF.Hepatic steatosis:innocent bystander or guilty Party〔J〕?Hepatology，1998;27(6):1463-6.

8 Leeler G，Horsmnas Y，Desager JP，et al.Reduction in CYP activities is correlated to the degree of fat liver content in two animal models of nutritional steatosis〔J〕.Hepatology，1996;24:311.

9 Younossi ZM，Diehl AM，Ong JP.Nonalcoholic fatty liver disease:an agenda for clinical research〔J〕.Hepatology，2002;35(4):746-52.

10 Wagner BA，Buettner GR，Burns CP.Vitamin E slows the rate of free radical-mediated lipid peroxidation in cells〔J〕.Arch Biochem Biophys，1996;334(2):261-7.