NGF誘導PC12細胞分化早期和晚期結構蛋白的變化

侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經內科，北京 100038)

神經生長因子(NGF)是神經系統中最重要的生物活性物質之一，它掌控著神經元的生存、分化、生長發育、凋亡等重要生理功能，也參與受損神經的再生和功能修復〔1〕。本研究在建立NGF誘導PC12細胞分化模型的基礎上，應用蛋白質組學技術篩選NGF誘導PC12細胞分化過程的結構相關蛋白，探索細胞形態變化的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM購自Gibco公司。神經生長因子購自廈門北大之路生物工程有限公司。CyDye熒光標記物、24 cm固相pH梯度干膠條、胰蛋白酶、Clean-up試劑盒、2D Quant定量試劑盒等均購自GE Healthcare-Biosciences公司。谷氨酰胺、hACTH(19～39)和AngⅢ均購自美國Sigma公司。倒置相差熒光顯微鏡為日本O-lympus產品;蛋白質組學設備由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導PC12細胞分化模型的建立 PC12細胞培養于DMEM培養基中(含10%新生牛血清、1%谷氨酰胺)，于37℃、5%CO2培養箱中培養。將同一批細胞分為實驗組和對照組，按1×105個/ml密度接種，培養24 h后，在實驗組中加入50 ng/ml NGF，而在對照組中加入等體積培養液。給藥后分別于0、6、96 h進行吖啶橙和溴化乙啶染色，之后觀察細胞形態的變化。

1.3 蛋白質組學分析 選取四批不同代數的細胞，培養24 h后，實驗組加入NGF、對照組中加入培養液，再培養6 h或96 h。小心刮取細胞，2 000 r/min、4℃離心5 min，向沉淀中加入細胞裂解液，19 500 r/min、室溫離心30 min，取上清。應用Clean-up試劑盒去除樣品雜質，2D Quant定量試劑盒進行蛋白質定量。分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標記相應的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標記內標，冰浴避光30 min。按照蛋白質組學的操作說明，將3種熒光標記的樣品混合在一起，上樣至相應膠槽中，固相pH梯度干膠條放入膠槽，然后置于Ettan IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀上，按自動程序進行水化與等電聚焦。經2次平衡，將IPG膠條轉移至12.5%的SDS-PAGE膠上端，進行電泳。用Typhoon 9400激光掃描儀進行掃描，用DeCyder差異分析軟件，找出蛋白表達差異點。

1.4 差異蛋白點的鑒定 從實驗組和對照組中各取600μg蛋白，上述同樣方法進行制備膠的制作，考馬斯亮藍染色。切取與差異表達點相匹配的蛋白點，用20 ng/μl胰蛋白酶將蛋白點于37℃酶切2 h。樣品與等體積基質混勻后進行點樣，將MALDI-TOF質譜儀所測的肽質量指紋譜數據輸入NCBI蛋白質數據庫進行檢索。

2 結果

2.1 NGF作用下PC12細胞形態學變化 光鏡下動態觀察NGF作用下PC12細胞的形態學變化，對照組大多數PC12細胞呈圓形，散在生長或聚團生長，為未分化細胞(圖1A);而在NGF作用6 h以后細胞開始長出神經突起(圖1B);至96 h時細胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細胞長出長突起，不同細胞的突起可連接成網(圖1C)。

圖1 對照組與NGF處理組PC12細胞的形態(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

圖2 NGF誘導PC12細胞分化晚期MALDI-TOF MS鑒定的細胞結構蛋白

2.2 NGF誘導6 h和96 h細胞差異表達的結構蛋白50 ng/ml NGF作用于PC12細胞6 h，提取全細胞蛋白，與對照組比較，質譜鑒定后，沒有差異表達的結構蛋白被鑒定出來。

而用DeCyder BVA軟件分析NGF誘導PC12細胞分化晚期(96 h)的細胞蛋白質表達量差異，并進行蛋白質鑒定，發現5種表達增高的結構蛋白質，在雙向膠上分布見圖2A，其中點A為神經絲蛋白-M(NF-M)，點B是神經絲蛋白-L(NF-L)，點C為微管蛋白α-2(tubulinα-2)，點D是微管蛋白β-15(tubulinβ-15)，點E為原肌球蛋白(TM)。

3 討論

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞，能合成、貯存并釋放適量的兒茶酚胺。用NGF處理該細胞，可使其分化為交感神經元樣細胞，從而在形態、生理、生化及功能方面更接近于神經元，是在分子水平上研究神經元分化的重要模型。

與傳統生物化學方法相比，蛋白質組學是一種高通量、高分辨率的蛋白質研究方法，擯棄了對單一或少數蛋白質分割式的研究模式，使得在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其特有的活動規律成為可能，從而獲得有關蛋白質性質、表達變化及翻譯后修飾等方面的大規模信息。隨著研究不斷深入，蛋白質組學在解釋諸如生長、發育、代謝調控等生命活動規律上將有所突破，也將為探討重大疾病的發病機制、診斷和預防、新藥開發提供重要的理論基礎。本實驗結果顯示，NGF誘導PC12細胞分化96 h，神經絲蛋白(NF-M和NF-L)、微管蛋白tubulinα-2和tubulinβ-15以及TM這5種細胞骨架蛋白表達顯著增高，而NGF誘導PC12細胞分化6 h，上述蛋白質表達與對照組比較均無變化。

微管是細胞骨架中最粗的一種纖維絲，是細胞內囊泡、細胞器和蛋白質交通運輸的軌道。微管蛋白為球形分子，分為兩種類型:α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，這兩種微管蛋白具有相似的三維結構，能夠緊密地結合成二聚體，作為微管組裝的亞基，能夠聚合并且參與細胞分裂。β-tubulin有Ⅰ～Ⅵ六種亞型，其中Ⅱ、Ⅲ型是神經元特異性蛋白，在NGF作用于PC12細胞時其表達量增高數倍〔2〕。本實驗中β-tubulin含量顯著增高可能是Ⅱ、Ⅲ型β-tubulin表達上調所致。

NF是神經元特有的中間絲蛋白(10～12 nm)，分為NF-L、NF-M和NF-H三種不同類型。它們與其他中間絲蛋白相互聚合形成網絡，主要起支持作用，是構成神經元骨架的主要成分。已有研究報道NGF誘導分化的PC12細胞中NF-L和NF-M表達增強〔3〕，這與本實驗結果符合。

微絲為直徑5～6 nm的雙股螺旋細絲，由肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和輔肌球蛋白組成。本實驗中，點E被鑒定為TM，它是上述微絲收縮過程中重要的調節蛋白質。Barbara等曾報道:腦源性神經營養因子(BDNF)作用于成神經細胞瘤細胞使TM-3上調，而NGF處理的TrkA-SY5Y細胞中該蛋白表達下調〔4〕。本實驗中NGF處理組TM表達顯著增高，這可能是由不同細胞系和不同實驗條件所造成。TM上調與NGF引發的PC12細胞分化、細胞骨架蛋白表達增高等一系列現象相符，并可增強細胞的活動能力。

比較NGF處理6 h和96 h兩組實驗結果發現:NGF處理96 h時PC12細胞發生顯著形態學變化，此時許多蛋白質表達發生顯著變化。其中 NF-M、NF-L、tubulinα-2、tubulinβ-15和 TM等細胞結構蛋白表達顯著上調，這與細胞形態學觀察所見相符。這些差異主要反映了NGF形態學變化和細胞構成變化的一致性。本實驗為研究NGF誘導PC12細胞分化的機制提供了線索，也為深入進行神經保護藥物的研發提供了新的線索。

1 孫小單，李羽佳，佟曉杰.神經生長因子促進神經再生作用的研究進展〔J〕.遼寧醫學院學報，2010;31(4):377-80.

2 Joshi HC，Cleveland DW.Differential utilization of beta-tubulin iso-types in differentiating neurites〔J〕.JCell Biol，1989;109:663-73.

3 Schimmelpfeng J，Weibezahn KF，Dertinger H.Quantification of NGF-dependent neuronal differentiation of PC-12 cells by means of neuro-filament-L mRNA expression and neuronal outgrowth〔J〕.J Neurosci Methods，2004;139(2):299-306.

4 Sitek B，Apostolov O，Stuhler K，et al.Identification of dynamic proteome changes upon ligand activation of Trk-receptors using two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Mol Cell Proteomics，2005;4(3):291-9.