基于DcR3的樹突細胞疫苗對CD8+T細胞的免疫抑制效應

李樹法 向 菲 李海英 黎姍姍 梁 愿 張 敏

(貴陽市第一人民醫院內分泌科，貴州 貴陽 550002)

誘騙受體3(DcR3)是最近新發現的能與淋巴毒素類似物(LIGHT)、Fas配體(FasL)競爭性結合并抑制其活性的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員之一，對LIGHT和Fas兩大系統的調節起重要的作用〔1，2〕。DcR3抑制了LIGHT及FasL介導的凋亡，有助于腫瘤細胞、活化的自身免疫細胞免受機體免疫系統的清除，從而被認為與某些腫瘤、自身免疫病的發病有關，因此是一種具有免疫抑制作用的分子〔3～5〕。本研究擬將DcR3腺病毒轉染到樹突細胞(DC)表面，制備DcR3特異的DC疫苗，觀察該疫苗對同種異體的CD8+T細胞的免疫抑制作用，為自身免疫疾病的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 8月齡Balb/c和C57BL/6小鼠購自重慶醫科大學動物實驗中心。重組DcR3(Ad-DcR3)腺病毒和攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的重組腺病毒(Ad-LacZ)由第三軍醫大學免疫學研究所提供，粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)和 TNF-α 購自美國 R＆D systems，Minneapolis。CD8+T細胞分離試劑盒購自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細胞懸液制備 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟放于冷Hank液中，剪碎并反復碾磨通過200目的無菌銅網，收集懸液并用紅細胞溶解液去除紅細胞，再用大量Hank's液洗滌細胞2次，1 200 r/min離心10 min，用RPMI1640培養液重懸，計數。

1.2.2 免疫磁珠分選(MACS)純化CD8+T細胞 取4×107細胞，1 200 r/min離心10 min，去上清液后用160μl緩沖液重懸，加40μl抗體Cocktail充分混勻，4℃孵育10 min。加160μl緩沖液，1 200 r/min離心10 min，去上清液，再加入320μl緩沖液、80μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r/min離心10 min。吸除上清液，用500μl緩沖液重懸細胞，200目篩網過濾成無氣泡的單細胞懸液。將MS細胞分離柱置于MACS磁力架上，先用500μl緩沖液洗柱，再將細胞懸液通過MS柱，1 500μl緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細胞，計數。

1.2.3 DC的培養及鑒定 取8周齡Balb/c小鼠，脫頸處死，用體積分數為75%的乙醇溶液浸泡5 min，無菌條件下切開皮膚及皮下組織，分離小鼠股骨和脛骨，用濃度為0.01 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3～5次，剪斷股骨和脛骨兩端，用濃度為0.01 mol/L的無菌PBS反復沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心 5 min去掉脂肪層，細胞用濃度為0.01 mol/L的無菌PBS重懸，再緩慢加入等體積Percoll細胞分離液，3 000 r/min離心 30 min，收集單核細胞，用濃度為0.01 mol/L的無菌PBS洗滌2次，再用含血清的DMEM培養基重懸，所得單細胞懸液接種于T-25培養瓶內，并補充GM-CSF和IL-4，置溫度為37℃、CO2氣體體積分數為5%和飽和濕度的培養箱內培養，隔日半量換液補充細胞因子，第7天收獲細胞，即得DC。采用光鏡觀察DC的形態。

1.2.4 重組酶腺病毒對DC的體外轉染 將DC置于6孔培養板中，每孔3×106個細胞，實驗組每孔加入1×109Pfu的Ad-DcR3或Ad-LacZ重組腺病毒1 ml，空白對照組每孔加入1 ml PBS，在37℃5%CO2飽合濕度下繼續培養48 h。

1.2.5 Western印跡檢測DcR3蛋白的表達 收集感染48 h的各組細胞，提取總蛋白。取40μg蛋白樣品進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，半干轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h以封閉非特異反應物。封閉后的膜與1∶100稀釋的DcR3一抗4℃孵育過夜。Tris緩沖液(TBS)洗膜，與1∶2 000稀釋的二抗孵育120 h。TBS洗膜，化學發光試劑盒反應3 min，膠片曝光，拍照。實驗中以β-actin作為內參。

1.2.6 混合淋巴細胞培養實驗 采用混合淋巴細胞培養，取Balb/c的DC與C57BL/6的CD8+T細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml，將兩種細胞混合置于96孔培養板，每孔分別加入細胞各100μl，每組設3個復孔，置入37℃、5%CO2的孵育箱中，分別培養72 h。

1.2.7 淋巴細胞增殖能力檢測 細胞混合培養后，每孔加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，繼續培養12 h，用PBS漂洗細胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預冷的體積分數為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，轉移入閃爍瓶中，加入5 ml閃爍液，用液體閃爍計數器計數每分鐘的閃爍次數(cpm)，測定DPM值(反映細胞DNA合成速率)，重復測定3次。

1.2.8 細胞因子的ELISA檢測 混合淋巴細胞培養72 h后，取培養上清液，用ELISA試劑盒檢測培養液中的γ-干擾素(IFN-γ)水平。具體步驟參照試劑說明書。

1.3 統計學分析 采用SPSS統計軟件對數據進行方差分析、t檢驗。

2 結果

2.1 DC的光鏡觀察結果 用光鏡觀察DC的形態，DC誘導成熟后，細胞呈不規則形，并形成大量的毛刺突出。證明經細胞因子誘導后，可以誘導脾臟單個細胞向DC的分化。見圖1。

圖1 DC的形態觀察結果(×40)

2.2 細胞轉染與Western印跡分析結果 將Ad-DcR3對DC進行轉染，Western印跡分析DcR3的表達情況。Ad-DcR3可介導DcR3的有效表達，而陰性對照則未出現條帶。見圖2。

圖2 Western印跡檢測DcR3的表達

2.3 淋巴細胞增殖能力檢測 Ad-DcR3組的CD8+T細胞cpm值為36 000±3 400，Ad-LacZ組為51 000±4 800，PBS組為54 000±6 500。實驗證明轉染Ad-DcR3的DC對同種異體的CD8+T細胞具有抑制增殖的作用(P＜0.05)。

2.4 淋巴細胞分泌IFN-γ的檢測 Ad-DcR3組的CD8+T細胞 IFN-γ分泌值為(42.8±5.7)pg/ml，Ad-LacZ組為(98.4±11.9)pg/ml，PBS組為(96.5±10.2)pg/ml。實驗證實轉染Ad-DcR3的DC對同種異體的CD8+T細胞具有抑制細胞因子分泌的作用。

3 討論

DcR3屬于TNF受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成員，其開放閱讀框編碼300個氨基酸。其基因定位于20q13.3，含有4個半胱氨酸富集區〔6〕。它是一種表面受體，也是一種凋亡抑制蛋白(IAP)，DcR3的配體均是TNF家族成員，包括FasL、LIGHT和TL1A。它可干擾FasL或淋巴毒素β受體介導的凋亡，還可通過阻斷NFR-2和LIGHT之間的雙向信號轉導、TL1A致死亡受體3(death receptor3，DR3)的單向信號轉導，抑制T細胞共刺激〔7～9〕。因而DcR3在腫瘤逃逸及轉移、自身免疫性疾病、移植排斥反應中扮演了重要的角色，可為這些疾病的診斷、治療、療效觀察和預后判斷提供新的思路，故逐漸受到人們的重視。

DC是目前體內功能最強大的專職抗原遞呈細胞，是機體T細胞特異免疫應答的直接啟動和調控者〔10，11〕，其強大的專職性遞呈作用和啟動初始T細胞的能力，日益成為國內外學者研究的熱點。它最大的特點是能夠顯著刺激初始型T細胞增殖活化〔11～13〕，因此DC是機體免疫反應的始動者，在免疫反應的誘導中具有獨特的地位。采用基因修飾方法制備DC疫苗用于主動免疫治療是一種理想的免疫治療方法〔14，15〕。

為了證實DcR3基因修飾DC的免疫效應，本研究將該基因修飾的DC刺激同種異體的CD8+T細胞，采用3H-TdR和ELISA法檢測DC對CD8+T細胞的免疫抑制情況。結果提示DcR3基因修飾DC能抑制同種異體的CD8+T細胞的增殖和細胞因子(IFN-γ)的分泌。因此，重組DcR3腺病毒轉染的DC對CD8+T細胞具有免疫抑制效應，為下一步在自身免疫疾病的防治研究工作提供了工具和理論基礎。

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