pcDNA3.1-HIF-1α重組質粒的構建及其初步鑒定

劉榮福 占鵬程 李博安

(廈門大學附屬第一醫院泌尿外科，福建 廈門 361003)

缺氧誘導因子-1(HIF-1)是在缺氧狀態下調節機體或細胞對缺氧反應中的一種核轉位因子〔1〕，廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞。HIF-1由α和β兩種亞基組成的異二聚體蛋白，其中α亞基受缺氧或低糖調節，在缺氧時較穩定，活性大大增強〔2〕，通過與其下游的靶基因特定序列DNA結合而調控他們的轉錄和翻譯，如血管內皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生長素(EPO)、葡萄糖轉運和糖酵解酶、誘導型 NO 合酶(iNOS)〔3〕，血管形成及糖酵解酶活性增加，使腫瘤細胞適應缺血缺氧環境，維持生存與發展的需要，這在腫瘤的發生發展中具有重要作用。本課題成功構建了HIF-1α過表達重組質粒(pcDNA3.1-HIF-1 α)并轉染到前列腺癌細胞株(PC-3)，建立了pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3細胞株，為研究前列腺癌與HIF-1α提供了一個可靠工具。

1 材料與方法

1.1 材料 人PC-3、pcDNA3.1質粒、大腸桿菌DH5α由廈門大學生命科學院提供。HIF-1α鼠抗人抗體購自Santa Cruz公司，羊抗鼠IgG二抗購自武漢博士德公司，Fugene轉染試劑購自羅氏公司，膠回收試劑盒、質粒抽取試劑盒均購自OMEGA公司，細胞總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，ECL試劑盒購自Pierce公司，胎牛血清、1640培養基系Gibco公司產品。實驗所用試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 從Genbank檢索出HIF-1αcDNA序列，根據Primer設計軟件，HIF-1α基因上游引物:5'-CGGGATCCTCTCTAGTCTCACGAGGGGTTTCC-3';下游引物:5'-GCTCTAGAGATGCTACTGCAATGCAATGGTT-3'，兩 端 引 入BamHⅠ和XbarⅠ酶切位點，擴增片段2.89 kb，由廣州英駿生物公司合成。

1.2.2 HIF-1α片段擴增 采用TRIZOL試劑，裂解PC-3提取總RNA，經RT-PCR方法(具體操作參考RT-PCR試劑盒)擴增HIF-1α基因片段，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min。循環35次。末次循環后72℃再延長10 min，依照膠回收試劑盒說明書回收擴增片段。

1.2.3 pcDNA3.1-HIF-1α重組質粒的構建及鑒定 將RTPCR擴增產物與pcDNA3.1質粒用BamHⅠ和XbarⅠ37℃雙酶切過夜，膠回收酶切產物。在15μl的連接反應體系中，加入1.5μl 10×緩沖液，1μl T4DNA連接酶，9.5μl的PCR擴增產物，3μl的pcDNA3.1載體，4℃連接過夜，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5μα，搖勻，小量抽取質粒(具體步驟參照質粒抽取試劑盒)，酶切，菌落PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性重組子。

1.2.4 序列測定 由上海英駿生物公司完成。采用雙脫氧鏈末端中止法，以DNA全自動測序儀測定核苷酸序列，同一片段經正反兩個方向重復測定。

1.2.5 pcDNA3.1-HIF-1α重組質粒的轉染 中量抽提鑒定正確的pcDNA3.1-HIF-1α真核表達質粒，純化，取培養于6 cm培養板中處于對數生長期的PC-3細胞經Fugene轉染(具體操作參考Fugene轉染說明書)。轉染后培養48 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察、計數發綠色熒光細胞數，每孔取5個視野，取其平均值計算轉染效率，計算公式為:細胞轉染率=(同一高倍鏡下綠色熒光細胞總數/同一高倍鏡下細胞總數)×100%。

1.2.6 重組質粒pcDNA3.1-HIF-1α的表達鑒定 Western印跡檢測HIF-1α蛋白表達情況。取轉染48 h處于對數生長期的pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3和pcDNA3.1-PC-3細胞，快速裂解法裂解細胞，13 000 r/min，30 min，4℃，用 Bradford法取上清液測蛋白濃度，按上樣量一致加樣，均為80μg，于8%的SDSPAGE 電泳，120 V，90 min，電泳完后轉膜，300 mA，90 min，將膜置于5%的牛奶中室溫封閉60 min，4℃兔抗人HIF-1α多克隆抗體(稀釋度為1∶1 500)雜一抗過夜，TBST洗膜10 min×3次，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG(稀釋度為1∶5 000)雜二抗60 min，Tris緩沖鹽水(TBST)洗膜10 min×3次，ECL顯影，曝光。

2 結果

2.1 HIF-1α擴增片段 PC-3細胞內抽提的RNA逆轉錄為cDNA，經PCR合成儀擴增HIF-1α片段，瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條大小約2900bp的條帶，見圖1。

2.2 菌落PCR鑒定陽性克隆 4℃連接后轉化大腸桿菌，鋪板，挑取連接后的菌落采用PCR方法擴增HIF-1α片段，結果能擴增2.89kbp大小的片段的菌落為陽性克隆，即為連接有HIF-1α片段的重組質粒，見圖2。

圖1 PCR擴增產物

圖2 菌落PCR

圖3 重組質粒pcDNA3.1-HIF-1α酶切鑒定

2.3 HIF-1α重組質粒的酶切鑒定 取pcDNA3.1-HIF-1α陽性克隆小量制備質粒，經BamHⅠ和XbarⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，所得結果與pcDNA3.1載體和HIF-1α片段大小一致，約5.3kbp和2.89kbp，經DNA測序證實HIF-1α擴增片段與Genebank公布一致。見圖3。

2.4 轉染效率的檢測 質粒轉染前列腺癌效率為(43.24±2.56)%，綠色熒光蛋白表達情況，見圖4。

2.5 重組質粒pcDNA3.1-HIF-1α的表達鑒定 在pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3細胞內高表達，而在pcDNA3.1-PC-3細胞內條帶較pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3弱，表明重組質粒 pcDNA3.1-HIF-1α在前列腺癌細胞內能夠表達。見圖5。

圖4 質粒轉染PC-3細胞48h綠色熒光蛋白表達情況

圖5 PC-3細胞內HIF-1α蛋白表達情況

3 討論

腫瘤細胞具有很強的增殖能力，在其發展過程中局部腫瘤組織生長超過周圍血管生長速度，必然導致局部組織缺血缺氧，在該種缺氧情況下會誘導HIF-1α的表達，進而進入細胞核與HIF-1β結合，然后與其下游的靶基因的缺氧反應元件(HRE)的HIF-1α結合位點結合，促使VEGF表達及葡萄糖轉運和糖酵解酶活性增加，血管形成及能量代謝增強，維持腫瘤細胞的生存和發展。此外，近幾年研究還發現，HIF-1α過表達能抑制細胞凋亡〔4〕、調節細胞周期蛋白(Cyclin)〔5〕，影響腫瘤分裂以及干擾生長因子〔6〕合成與分泌，促進細胞生長等多種途徑增強腫瘤生存能力。Zhong〔7〕研究發現在前列腺癌組織和癌前病變及癌遠處轉移的病灶中HIF-1α均有不同程度的高表達，而在正常的前列腺組織和良性病變中卻未發現HIF-1α蛋白過表達，表明其與前列腺癌的發病之間有著密切的關系。

為了探討HIF-1α與前列腺癌發病機制之間的關系，本實驗構建重組質粒pcDNA3.1-HIF-1α，酶切，電泳，目的片段位于2.89kb左右，載體片段位于5.3kb，和預期結果一致，序列測定所擴增的HIF-1α片段與Genbank報道一致，然后經轉化至大腸桿菌進行擴增，中量抽提，轉染至PC-3細胞，48h后轉染效率約為45%左右，重組質粒能夠在細胞內表達，且其表達量要高于PC-3細胞。

隨著人口老齡化、生活水平的提高，我國前列腺癌的發病率正逐漸上升，病死率較高〔8〕，而目前尚缺乏有效地治療方法。HIF-1α在腫瘤細胞內高表達，可作為腫瘤生物研究的重要參照物〔9〕。成功構建HIF-1α穩定表達的重組質粒pcDNA3.1-HIF-1 α，將為研究HIF-1α與前列腺癌發病機制之間的關系提供了一個有力工具，并有望作為臨床上前列腺癌的早期診斷指標和腫瘤標記物，間接為前列腺癌的早期診斷及治療提供較大的幫助。

1 Semenza GL. HIF-1 and human disease: one highly involved factor〔J〕.Genes Dev， 2000; 14( 16) : 1983-91.

2 Lando D，Peet DJ，Whelan DA， et al. Asparagine hydroxylation of the HIFtransactivation domain a hypoxic switch〔J〕. Science，2002; 295( 5556) :858-61.

3 Rankin EB，Giaccia AJ. The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis〔J〕. Cell Death Differ， 2008; 15( 4) : 678-85.

4 Akakura N，Kobayashi M，Horiuchi I， et al. Constitutive expression of hypoxia-inducible factor-1alpha renderes pancreatic cancer cells resistant toapoptosis induced by hypoxia and nutrient deprivation〔J〕. Cancer Res，2001; 61( 7) : 6548-54.

5 Ros R， van Diest PJ，Groep P， et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha and cell cycle proteins in invasive breast cancer are estrogenreceptor related〔J〕. Breast Cancer Res， 2004; 6( 4) : 450-9.

6 Ros R， van Diest PJ，de Jong JS， et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha isassociated with angiogenesis，and expression of bFGF，PDGF-BB，andEGFR in invasive breast cancer〔J〕. Histopathology，2005; 46( 1) : 31-6.

7 Zhong H，De Marro AM，Laughner E， et al. Overexpression of hypoxia-induciblefactor 1 alpha in common human cancers and their metastases〔J〕. Cancer Res，1999; 59( 22) : 5830-5.

8 葉定偉，李長嶺.前列腺癌發病趨勢的回顧和展望〔J〕.中國癌癥雜志，2007;17(3):177-80.

9 Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 and cancer pathogenesis〔J〕.IUBMB Life， 2008; 60( 9) : 591-7.