植物雌激素α-玉米赤霉醇對去卵巢大鼠骨組織雌激素受體α和βmRNA的影響

李少春 段 斐 程 煒 高 文 崔 娜

(河北大學基礎醫學院，河北 保定 071000)

絕經后骨質疏松(OP)是一種婦女絕經后體內雌激素水平下降導致的一種以骨轉換增加、骨量丟失為特征的骨代謝性疾病。傳統的治療方法主要為激素替代療法(HRT)，但是HRT長期應用所產生的不良反應使其應用受到很大限制。而α-玉米赤霉醇(α-ZAL)是一種新型植物雌激素，具有雌激素樣作用，而對子宮內膜癌、乳腺癌等發病率無明顯影響，甚至對子宮、乳腺具有潛在保護作用。α-ZAL具有改善絕經后OP骨生物力學指標的作用，能對絕經后OP發生產生一定防治作用，但其具體機制還不清楚。本實驗擬觀察應用α-ZAL治療后去卵巢大鼠骨組織雌激素受體α和βmRNA的變化，為探討其防治絕經后OP的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 α-ZAL(sigma公司);戊酸雌二醇片為廣州仙靈制藥公司生產(批號:145A13);Trizol試劑為北京邁晨科技有限公司產品;一步法RT-PCR試劑盒購自北京康為世紀生物公司。大鼠ERα、β和β-actin引物，北京奧科生物公司合成。

1.2 動物分組 6月齡雌性SD大鼠40只，體重250～300 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:906155。大鼠實驗室適應1 w后隨機分為空白對照(Sham)組、模型組、雌二醇(OVX+E2)組、α-ZAL組(OVX+α-ZAL)，每組10只。各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射(2 ml/kg)麻醉后，下腹正中備皮切口入腹，將卵巢牽拉出腹腔外，除Sham組外，其余各組結扎血管后完整切除雙側卵巢，Sham組開腹后切除卵巢旁一小塊脂肪組織，不切除卵巢，然后將腹腔分層縫合。術后給予青霉素20萬U肌肉注射抗炎，每天1次，連續3 d。手術后第3周開始灌胃給藥，OVX+E2組給予戊酸雌二醇1 mg/kg，OVX+α-ZAL組給予α-ZAL 1 mg/kg，每日1次，Sham組和模型組灌胃相應體積生理鹽水，連續灌胃12 w。實驗結束時，分離大鼠雙側脛骨，將附著于骨表面的肌肉及結締組織剔除干凈，雙側脛骨放入凍存管中，標記后投入液氮保存。

1.3 各組大鼠骨組織中ERα和 βmRNA表達情況 Trizol一步法提取骨組織總RNA，應用HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒擴增 ERs基因片段。ERα上游引物為5'-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3'，下游引物為 5'-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3'，擴增產物為345 bp;ERβ的上游引物為5'-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3'，下游引物為 5'-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3'，擴增產物為286 bp。以β-actin作為內參照，上游引物為5'-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3'，下游引物為5'-GGCAACATAGCACAGCTTCT-3'，擴增產物為216 bp。擴增條件為:45℃反轉錄30 min;95℃預變性2 min;94℃變性15 s，60℃退火、延伸30 s，30個循環;72℃終延伸5 min。

1.4 RT-PCR產物半定量分析 取10μl PCR產物，加入2μl上樣緩沖液，混勻，分別加入樣品，在1×TAE緩沖液中60 V電泳1 h，美國Bio-Rad公司凝膠成像儀下觀察拍照，掃描后應用Molecular Analyst分析軟件，對陽性電泳條帶進行吸光度峰值下面積積分，將 ERα(或 ERβ)/β-actin的比值作為 ERα(或ERβ)mRNA表達水平的相對量

1.5 統計學處理 采用SPSS14.0軟件，結果以x±s表示，總體進行方差分析，組間比較用LSD法。

2 結果

RT-PCR結果顯示大鼠去卵巢后，ERα和βmRNA表達量較Sham組明顯降低(P＜0.05)，經雌激素治療后，ERα和β mRNA出現上調(P＜0.05)，而α-ZAL能上調ERαmRNA水平，對于ERβmRNA與模型組比較無顯著差異(表1和圖1)。

表1 各組大鼠ERα和ERβmRNA表達情況(x±s)

圖1 各組大鼠脛骨ERα和βmRNA表達電泳結果

3 討論

雌激素是通過與其受體ER結合發揮作用的，ER屬于核受體超家族成員，主要包括兩種亞型:ERα和β，ERα是在1986年首先被克隆，隨后ERβ在1996年被克隆出來。ERs屬于甾體激素受體超家族，ERα和β結構相似，因此其在功能上也有相似性。兩種ER在組織中分布不同，ERα主要存在于子宮和乳腺，而ERβ主要存在于中樞神經系統、心血管系統、免疫系統、骨、腎、肺等。ERs在骨骼細胞的密度極低，因此一直以來認為雌激素對骨的作用是間接產生的，但隨著ERs在骨骼細胞的發現，人們逐漸認識到骨骼是雌激素直接作用的靶器官，ERs在骨骼細胞上的表達與骨量增長和維持有密切關系。雌激素可以與骨骼細胞上ERs特異性結合，調節成骨細胞和破骨細胞活動，介導雌激素和骨吸收、骨形成之間的聯系，從而對骨代謝起重要調控作用。因而，ERs是調控骨吸收和骨形成的重要樞紐，也是絕經后OP形成的重要樞紐。因此，研究ERs在OP發生過程中的作用及其變化對于更好地探明絕經后OP的發病和藥物防治絕經后OP的機制更為重要。雖然ERα和β結構相似，但其在調節骨代謝過程中扮演了不同的角色，兩者在空間分布和表達數量上也存在一定差異。Onoe等〔1〕發現原代大鼠成骨細胞的ERβmRNA水平明顯高于ERαmRNA，同時還發現，ERβmRNA在松質骨中的表達水平高于皮質骨，這解釋了絕經后小梁骨的受累程度較皮質骨嚴重而容易骨折的原因。ERα和β對骨代謝的作用還存在一定差異。應用基因敲除技術研究發現，ERα和β雖然共同參與雌激素的骨保護效應，但這種效應主要是由ERα介導的。本實驗結果顯示骨組織細胞中ERβmRNA的表達較ERα高，與上述結果一致。

ERs主要存在于成骨細胞和生長板的軟骨細胞，而破骨細胞和骨細胞中的表達水平較低。而且，隨著骨齡的增長和骨細胞發育分化，ERs表達水平也呈現一定動態變化。Lanyon等〔2〕發現，隨著增齡，骨細胞上的ERs密度逐漸減少。Onoe等還發現，隨著成骨細胞的分化成熟，ERβmRNA表達呈現持續性高表達，而ERαmRNA表達則呈現逐漸上升趨勢。

骨組織中ERs表達還與體內雌激素水平具有相關性，成骨細胞的分化程度及外界影響都可以改變ERs密度和兩種亞型比例〔3〕，劉博等〔4〕通過對不同月齡雌性大鼠成骨細胞中 ERα表達研究發現，ERα密度隨著月齡的改變和體內雌激素變化而呈現規律性變化。ERα和β表達水平與體內雌激素水平一致，并且雌激素受體表達有賴于體內雌激素的存在，雌激素水平降低后可使雌激素受體表達減少。因此，婦女絕經后由于體內雌激素水平下降，可以引起骨組織ERs表達水平下降，從而使雌激素對骨的作用減弱，成骨細胞凋亡增加，骨形成受到抑制，導致絕經后OP。研究發現，絕經后骨量減少，可能與骨骼細胞中缺乏ERα有關。骨組織細胞中ERs密度可以決定OP發病以及疾病嚴重程度，ERs表達水平越低，OP也就越嚴重。應用雌激素治療后，骨骼細胞內ERs mRNA表達出現上調，使雌激素對骨骼細胞的作用增強，從而產生防治OP的作用。

本研究結果提示α-ZAL具有與雌激素類似的作用，也可以調節ERαmRNA的表達而對絕經后OP產生治療作用，這可能是其防治絕經后OP的作用機制之一。但由于α-ZAL雌激素作用較弱，對ERβmRNA表達無明顯影響。

1 Onoe Y，Miyaura C，Ohta H，et al.Expression of estrogen receptor beta in rat bone〔J〕.Endocrinology，1997;138:4509-12.

2 Lanyon L，Armstrong V，Ong D，et al.Is estrogen receptorα key to controlling bone's resistance to fracture〔J〕.J Endocrinol，2004;182(2):183-91.

3 Waters KM，Rickard DJ，Riggs BL，et al.Estrogen regulation of human osteoblast function is determined by the stage of differentiation and the estrogen receptor isoform〔J〕.JCell Biochem，2001;83(3):448-62.

4 劉 博，陶樹清，尹文哲.雌性大鼠成骨細胞內雌激素受體表達的研究〔J〕.哈爾濱醫科大學學報，2004;38(2):179-81.