非小細(xì)胞肺癌中HLA-G的表達(dá)及其與IL-10的相關(guān)性

宋新宇 陳世雄 曾凡軍 高寶安 楊衛(wèi)兵

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

HLA-G在腫瘤中的免疫抑制功能越來越受到關(guān)注。在惡性黑色素瘤〔1〕，腎細(xì)胞癌〔2〕，肺癌〔3〕，卵巢癌、乳腺癌〔4〕和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中〔5〕均發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白的表達(dá)。HLA-G可阻止自然殺傷(NK)細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的凋亡和CD4+T細(xì)胞的同種增殖反應(yīng)〔6〕。除這些細(xì)胞間的相互作用外，HLA-G還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放及促進(jìn)輔助性T細(xì)胞比值(Th1/Th2)平衡向Th2方向的漂移來抑制免疫系統(tǒng)〔7〕。有報(bào)道顯示，Th2細(xì)胞因子中的IL-10誘導(dǎo)了HLA-G的表達(dá)，同時(shí)HLA-G似乎又反向刺激IL-10的表達(dá)〔8〕。而腫瘤細(xì)胞則可能通過該途徑對(duì)抗那些聚集到其周圍的免疫細(xì)胞〔9〕。本研究將探討HLA-G與IL-10在非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 患者和組織學(xué)標(biāo)本 通過外科切除的方式獲得38例肺癌標(biāo)本，這些患者術(shù)前均未接受放、化療。在切除腫瘤的同時(shí)獲取10例正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。這38位患者均來源于2007年5月至2008年6月間在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科住院患者，年齡32～75(平均62±12)歲，其中男27例，女11例。組織病理學(xué)分型:腺癌18例，鱗癌12例，大細(xì)胞癌8例。病理學(xué)分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例。所有組織標(biāo)本被冰凍保存于－80℃。

1.2 RNA提取與cDNA合成 用RNA提取試劑盒(Invitrogen，USA)按照其說明書從冰凍組織樣本中提取總RNA。取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA存放于－20℃直到使用時(shí)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HLA-G、IL-10 mRNA表達(dá) 用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Rotor-Gene RG-3000;Cobett Company，Australia)擴(kuò)增目標(biāo)cDNA序列。HLA-G和IL-10 PCR特異性擴(kuò)增引物序列如下:HLA-G正義鏈5-CTGGAGAACGGGAAGGAGAT-3;反義鏈5-GGGTGGCCTCATAGTCAAAG-3。IL-10正義鏈5-ATGCACAGCTCAGCACTGC-3;反義鏈5-TCAGTTTCGTATCTTCATTGTC-3。β-actin正義鏈5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3';反義鏈5'-TCCTTAATGTCACGCAGATTT-3'。

1.4 免疫組化法檢測(cè)HLA-G、IL-10蛋白表達(dá) 免疫組化反應(yīng)中所用的抗體:抗人HLA-G單克隆抗體4H84(Santa Cruz，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗體(BOSTER，CHINA)。以IL-10和HLA-G的染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比作為其標(biāo)記指數(shù)。至少在4個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(200倍顯微鏡視野下)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)資料用x±s表示，定性資料的統(tǒng)計(jì)用fisher精確概率法;定量資料的統(tǒng)計(jì)用t檢驗(yàn)或方差分析，兩因素相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10蛋白的表達(dá)38例肺癌標(biāo)本中有21例(55.3%)HLA-G蛋白表達(dá)陽(yáng)性，有23例(60.5%)IL-10表達(dá)陽(yáng)性。而正常肺組織中沒有檢測(cè)到HLA-G和IL-10的蛋白表達(dá)。見圖1。

圖1 HLA-G和IL-10蛋白在肺癌組織中的表達(dá)(×200)

2.2 非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10 mRNA的表達(dá) 正常肺組織標(biāo)本，均無HLA-G和IL-10 mRNA的表達(dá)。肺癌組織中HLA-G和IL-10 mRNA的表達(dá)量(2-△△Ct)分別是正常組織的 12.3倍(12.26±7.84，t=4.51，P＜0.01)和11.7倍(11.66 ±4.79，t=6.98，P ＜0.01)。

2.3 非小細(xì)胞肺癌中HLA-G和IL-10表達(dá)之間的關(guān)系 21例HLA-G蛋白表達(dá)陽(yáng)性的肺癌標(biāo)本中，有12例IL-10表達(dá)陽(yáng)性，9例IL-10表達(dá)陰性，Spearman相關(guān)分析示，兩者在蛋白表達(dá)水平無明顯相關(guān)(r=－0.077，P=0.646)。兩者在mRNA水平也沒有明顯相關(guān)性(r=0.006，P=0.969)。

2.4 HLA-G與患者臨床病理因素的相關(guān)性 非小細(xì)胞肺癌HLA-G mRNA和蛋白表達(dá)均與肺癌TNM分期成正相關(guān)(r=0.913，P ＜0.001;r=0.429，P=0.007)，晚期非小細(xì)胞肺癌HLA-G的表達(dá)是增高的。除此之外，未發(fā)現(xiàn)其他臨床病理因素與HLA-G的表達(dá)相關(guān)。見表1。

表1 HLA-G mRNA和蛋白表達(dá)水平與肺癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系

3 討論

雖然在腫瘤患者中，Th2細(xì)胞因子(IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)與腫瘤發(fā)展之間的臨床關(guān)系未被完全闡釋清楚，但目前認(rèn)為機(jī)體抗腫瘤免疫系統(tǒng)的損害與細(xì)胞因子平衡向Th2方向系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移有關(guān)。IL-10作為一種重要的Th2類細(xì)胞因子，可表達(dá)于不同腫瘤細(xì)胞中〔10〕。此外，IL-10作為一種重要的免疫抑制因子，其在創(chuàng)造有助于腫瘤生存的免疫抑制微環(huán)境中發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng)。Moreau等人研究結(jié)果顯示，在單核細(xì)胞中IL-10誘導(dǎo)HLA-G的表達(dá)可能起著下調(diào)免疫反應(yīng)的作用〔8〕。同時(shí)Singer等也發(fā)現(xiàn)IL-10陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)常位于HLA-G陽(yáng)性細(xì)胞周圍，HLA-G可能誘導(dǎo)了IL-10的表達(dá)〔4〕。先前也有研究表明，HLA-G能調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡朝Th2方向偏移，HLA-G被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)作用〔11〕。由此推測(cè)，在腫瘤的發(fā)展過程中，HLA-G和IL-10可能通過相互調(diào)節(jié)而促進(jìn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平HLA-G的表達(dá)與IL-10無相關(guān)性。由此推測(cè)，IL-10的表達(dá)可能是膜型HLA-G及其他多種因素共同作用的結(jié)果。已有相關(guān)研究顯示，無論是否有膜型HLA-G表達(dá)細(xì)胞的存在，可溶性HLA-G都可通過單個(gè)核細(xì)胞從另一方面增加 IL-10的產(chǎn)物〔12〕，且釋放入血的可溶性HLA-G可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡〔13〕或誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生〔14〕促使系統(tǒng)免疫無應(yīng)答。所以肺癌中可溶性HLA-G與IL-10的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。此外，分析表明HLA-G mRNA和蛋白表達(dá)均與肺癌TNM分期呈正相關(guān)。晚期肺癌患者腫瘤細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)較早期患者增高。這一結(jié)果提示，HLA-G可能在肺癌進(jìn)展中起重要作用，并可能成為評(píng)估肺癌預(yù)后的指標(biāo)。

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