全自動細胞圖像分析儀在胸腹腔積水診斷中的應用

張薇 汪鍵 程越清 劉巖 李永紅

1.襄陽市鐵路中心醫院病理科，湖北 襄陽 441003；

2.湖北省中山醫院細胞病理室，湖北 武漢 430033

胸腹水細胞學檢查在鑒別癌性、炎性胸腹水上起著關鍵性作用。胸腹水細胞中發現有惡性腫瘤細胞，即胸腹水是由惡性腫瘤引起的。相反，胸腹水細胞中沒有發現惡性腫瘤細胞，多數是由良性病變引起的。然而由于非典型增生的胸腹膜間皮細胞往往較難區別于惡性腫瘤細胞，可導致誤診。結合多項研究結果基礎上發現：常規細胞學診斷癌性漿膜積水敏感度為58%，特異度為97%［1］。近十年來，有很多新方法用于鑒別癌性與炎性胸腹水［2-6］。當DNA雙鏈中的倍體發生改變時，往往表示為惡性腫瘤細胞［7］。臨床上可用流式細胞儀和細胞圖像分析儀來測定細胞核內DNA改變。流式細胞儀可在較短時間內測定較多胸腹水細胞內DNA含量，但它不能對少量細胞的樣品進行形態學觀察分析；而細胞圖像儀可對少量細胞樣品進行DNA測定，也可進行形態學觀察分析，但測定時間較長。從研究結果看，細胞圖像分析儀較流式細胞儀敏感［8-9］。目前國內臨床上所用的細胞圖像儀多為手動的，需要用手來尋找可疑細胞，并對每一個細胞進行聚焦、測定，故需大量時間才能對少數細胞進行測量。全自動細胞圖像分析儀可克服以上缺點，對較多的細胞樣品進行全自動測定，從而避免了人為因素影響。本研究試用DNA全自動圖像分析儀研究惡性胸腹積水細胞中的非整倍體細胞。

1 資料和方法

1.1 研究對象

463例胸腹積水標本在2005年1月—2010年5月來源本院和多個外院(大多為可疑胸腹積水)送往本院檢測的。

1.2 標本處理

每例50～100 mL胸腹水細胞離心后(1 000×g，10 min)，經Sed-Fix固定液(美國Surgioath Medical Inc)固定20 min，再次離心，清洗后用涂片離心機(武漢蘭丁醫學高科技有限公司制成4張薄層細胞片。2張細胞片用Papanicotaou染色，常規細胞學檢查是由2位有30年經驗的細胞病理學專家做出。

1.3 結果判定

常規細胞學檢查結果分為3類：⑴炎性胸腹水(包括急性炎癥、結核和慢性炎癥)，⑵惡性腫瘤可疑胸腹水，⑶癌性胸腹水包(括惡性間皮瘤和轉移性癌等)。全自動DNA細胞圖像分析系統(DNA Image Cytometer，DNA-ICM，武漢蘭丁醫學高科技有限公司)測定方法，對每例4 000個以上的胸腹水細胞核進行自動聚焦測定每個細胞核的78個核特征，自動進行細胞分類和計數，自動打印DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖。二倍體細胞(G1/G0)的DNA含量為2c(c為DNA含量單位, DNA content)；四倍體細胞(G2/M期)的DNA含量為4c。2c細胞和4c細胞為整倍體細胞。DNA定量診斷癌性胸腹水的陽性指征分為3類：⑴3個或3個以上的大于5c非整倍體細胞，⑵在2.2c至3.6c之間或大于5c 位置形成一個非整倍體峰值或多個非整倍體峰值，⑶4c的細胞數占被測細胞總數10%以上時。

2 結 果

463例胸腹積水中，常規細胞學診斷炎性積水193例，轉移性腺癌177例，淋巴瘤16例，間皮瘤30例，疑為增生或核異質47例。經臨床和病理診斷證實，除疑為增生或核異質47例外，常規細胞學診斷正確。

2.1 診斷明確的416例胸腹積水病例DNAICM診斷結果

由表1可見，在193例炎性積水中DNA-ICM檢測未見非整倍體細胞。177例轉移性腺癌中只有2例未見非整倍體細胞，4例有1～2個非整倍體細胞，61例有3個或3個以上非整倍體細胞，110例為非整倍體細胞峰。16例淋巴瘤中有3例未見大于5c的非整倍體細胞，1例有2個非整倍體細胞，7例有3個或3個以上的非整倍體細胞，5例可見非整倍體細胞峰。30例間皮細胞瘤中，2例未見大于5c的非整倍體細胞，9例可見3個或3個以上的非整倍體細胞，19例可見非整倍體細胞峰。

2.2 非整倍體細胞峰(stemline aneuploidy)形式及分布

癌性胸腹水患者大多處于腫瘤晚期階段。在大多癌性胸腹水病例中，都可見非整倍體細胞峰。由表1可見，62%轉移性腺癌，38%的淋巴瘤和63%的間皮細胞瘤均可見非整倍體細胞峰。從峰的多少和形式來看，以上3種癌性胸腹水非整倍體細胞峰形見表2。非整倍體細胞峰可表現為單峰、雙峰、多峰或片狀峰3種形式。轉移性腺癌和間皮細胞瘤大多數都以單峰和雙峰形式存在。非整倍體細胞峰出現位置也不相同，但大多數出現S期，即2.2c至3.6c之間。由表3可見，83%轉移性腺癌和68%間皮細胞瘤非整倍體細胞峰分布在2.6c至3.4c之間。淋巴瘤胸腹水病例細胞在S期分布較有特點，即使無大于5c的非整倍體細胞，S期細胞分布成片。這種圖形明顯不同于轉移性腺癌和間皮細胞瘤(圖1、2)。

表 1 胸腹積水常規細胞學和DNA-IMC診斷結果Tab.1 Results of 416 serous effusions diagnosed by conventional cytology and DNA-ICM

2.3 ＞5c的非整倍體細胞數

比較多種胸腹積水中＞5c細胞的百分率(表4)，炎性積水沒有＞5c細胞，轉移性腺癌中約有3.8% ＞5c細胞，淋巴瘤和間皮細胞瘤分別有6.6%和6.2%的細胞＞5c。

表 2 癌性胸腹積水非整倍體細胞峰的峰形情況Tab.2 Number of stemline aneuploidy in malignant serous effusions

2.4 47個可疑病例DNA-ICM的診斷結果

表5顯示通過隨訪患者或家屬而確診了27例，另20例由于無法與患者或家屬聯系而不能最終明確診斷。在確診的10例炎性積水中，DNA-ICM發現8例有1～2個＞5c的非整倍體細胞。另外17例確診的癌性積水中均可見有＞5c的非整倍體細胞，其中有非整倍體細胞峰11例。

表 4 不同胸腹水＞5c細胞的百分率Tab.4 Percentage of ＞5c aneuploid cells in different effusions

表 3 不同DNA含量非整倍體細胞峰的分布Tab.3 Distribution of different stemline aneuploidy in malignant effusions

表 5 47例異型增生病例的DNA-ICM診斷結果Tab.5 Diagnosis of 47 suspicious cases by DNA-ICM

3 討 論

我們的研究結果與其他作者的研究結果一致［4-6,8-9］，DNA-ICM檢測炎性胸腹積水時，大多未見非整倍體細胞，即使可見非整倍體細胞，也只是1～2個。而癌性胸腹積水絕大多可見非整倍體細胞和非整倍體細胞峰。由此可見，癌性胸腹積水的癌細胞染色體倍數已發生了改變，用DNA-ICM可診斷和鑒別診斷炎性和癌性胸腹積水。

通過對DNA-ICM直方圖的分析，可鑒別不同性質的癌性胸腹積水。淋巴癌性胸腹積水非整倍體細胞多出現在S期，呈片狀分布；而轉移性胸腹水非整倍體細胞以細胞單峰形式出現在S期，并可在4c和8c之間出現第2個峰。非整倍體細胞峰愈多、染色體愈不穩定，腫瘤的惡性程度愈高，預后愈差。因此癌性胸腹水的DNA-ICM圖形也可用于腫瘤的惡性程度和預后的評估。

癌性胸腹積水中非整倍體細胞峰可有不同DNA含量，其原理不清楚。非整倍體細胞峰出現的位置主要決定于癌細胞內染色體的倍數。如果癌細胞的染色體倍數為正常細胞的1.5倍，那么，就可能在3c處出現一個峰；如果癌細胞染色體倍數為正常細胞的3倍，非整倍體細胞的峰就可出現在6c的位置。胸腹積水非整倍體細胞峰出現的不同部位可能與原發腫瘤種類、性質和發展程度有關。

DNA-ICM在診斷胸腹積水中尚存在問題，如⑴少數非整倍體細胞：從本研究中可見，極少數炎性和少數癌性胸腹積水中均可出現1～2個非整倍體細胞。因此，對1～2個非整倍體細胞如何處理要非常慎重。少數炎性胸腹積水細胞可出現細胞退變或核固縮，這些細胞在Feulgen染色時，可出現＞5c細胞。但這些＞5c細胞的數量和例數非常小。當出現1～2個大于5c細胞時，可反復檢查，做免疫組化等方法來鑒別炎性或癌胸腹積水。⑵DNA-ICM對成團的癌細胞不能識別：由于本研究所用DNA-ICM的軟件尚不能將成團的細胞分割開來。因此，DNA-ICM將這類細胞作為“垃圾”處理。轉移性腺癌細胞常聚集成團，DNA-ICM有時不能識別出來而誤診。

總之，DNA-ICM可用于診斷炎性或癌性胸腹積水，也可用它來判別癌性胸腹積水的性質和惡性程度。

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