塞來昔布對乳腺癌細胞株的放射增敏作用

牛國梁 王輝 謝榮俊 張樹友

南華大學附屬南華醫院普外科，湖南 衡陽 421002

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，對早期患者實行保乳治療加放療已是當今的總趨勢。放療正成為乳腺癌局部和區域治療的重要手段，但腫瘤細胞本身對放射線的敏感性差、在放療中存在放射抗拒等因素影響了放療療效，且放療不良反應大。因此，尋找一種高效低毒的放療增敏劑成為研究的熱點。塞來昔布(celecoxib)是環氧化酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的選擇性抑制劑，其具有高效低毒、胃腸道反應小等特點，研究發現塞來昔布不僅能抑制腫瘤的發生、發展，還能提高腫瘤放療和化療的敏感性，其確切機制尚不明確［1-2］。研究發現，PI3K/Akt信號通路在腫瘤的放射抵抗性中起重要作用［3］。本實驗研究塞來昔布對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞放射敏感性的影響，并探討塞來昔布是否通過阻斷PI3K/Akt信號通路提高其放射敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞由中國科學院上海生物化學與細胞研究所提供；PRMI 1640培養基、胰蛋白酶為美國GIBCO BRL公司產品；胎牛血清為杭州四季青公司產品；塞來昔布為美國輝瑞公司產品；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)為Sigma公司產品；鼠抗人pAkt、Akt單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體購美國Santa Cruz公司產品；羊抗兔二抗為北京中杉金橋生物公司產品；BCA蛋白定量檢測試劑盒為美國Pierce公司產品；ECL發光檢測試劑盒為聯科公司產品。

1.2 細胞培養

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，培養瓶貼壁面至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代一次，傳代后取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞照射

直線加速器為德國Siemens Primus，6MV X-ray，將直線加速器機架角度為180度，劑量率200 cGy/min，射野大小為10 cm×10 cm，源皮距(source skin distance，SSD)為100 cm，加1.5 cm等效組織(培養瓶倒置于治療床面，培養瓶的細胞面朝上，并在瓶面上加墊1.5 cm厚等效有機玻璃板)。

1.4 MTT法檢測塞來昔布的細胞毒性

取對數生長期細胞(細胞濃度為2×104mL-1)，以每孔200 μL接種于96孔板，于37 ℃，CO2體積分數為5%的培養箱中培養4 h貼壁后，換成含塞來昔布終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L和60 μmol/L繼續培養，對照組為含0.5%DMSO的培養液，每一濃度設4個復孔，培養24 h后，每孔加入MTT 20 μL(以PBS配成5 mg/mL)，繼續培養4 h后，每孔加DMSO 150 μL，震蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀上490 nm波長測定各孔的光密度值(D值)。以上實驗重復3次。按公式：細胞生長抑制率=(1-D實驗組/D對照組)×100%。計算藥物對MDA-MB-231細胞生長抑制率，并計算塞來昔布IC50和IC20，取IC20作為后續實驗濃度。

1.5 克隆形成實驗

MTT實驗得到塞來昔布IC20值20 μmol/L，即為實驗濃度。實驗分4組，對照組：含有和其他組相等濃度的DMSO溶解劑；藥物組：DMSO溶解的塞來昔布；照射組：X線照射；實驗組：塞來昔布聯合X線照射。對照組及藥物組于細胞貼壁后，分別更換含或不含20 μmol/L塞來昔布培養液繼續培養24 h，0.25%胰酶消化，懸浮細胞，臺盼藍檢測細胞活性并計數活細胞，按100個細胞/孔，接種于12孔培養板，無藥培養液繼續培養10 d左右。照射組及實驗組于細胞貼壁后，實驗組更換含20 μmol/L塞來昔布培養液，繼續培養24 h。照射組及實驗組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy X-ray照射，劑量率為200 cGy/min，照射后，消化、懸浮、計數活細胞，根據不同照射劑量(由低到高)，分別接種100、100、500、500、1 000、1 000個細胞于12孔培養板。無藥培養液繼續培養10 d左右，甲醇固定，Gimsa染色，低倍倒置顯微鏡下計數各孔細胞數大于50個的細胞集落數，計算存活分數，繪制劑量效應曲線?？寺÷?plating efficiency，PE)=對照組每孔克隆數/每孔細胞種植數×100%，以PE作為校正系數計算存活分數(surviving fraction，SF)，SF=實驗組每孔克隆數/(每孔細胞種植數×克隆率)，以單擊多靶數學模型擬合細胞存活曲線，計算出照射組和實驗組的準域劑量(Dq)、平均致死劑量(D0)、2 Gy照射的存活分數(SF2)值，放射增敏效應以放射增敏比(SERD0)表示，定義為照射組與實驗組的D0之比。上述實驗重復3次。

1.6 流式細胞分析法(flow cytometry，FCM)檢測腫瘤細胞凋亡

按上述實驗分組，取對數生長期的MDA-MB-231細胞2×106個消化，懸浮，接種于100 mL培養瓶中，37 ℃，CO2體積分數為5%的培養箱中培養，培養瓶貼壁面至70%～80%融合時，對照組及照射組更換含0.5% DMSO培養液，藥物組和實驗組更換20 μmol/L塞來昔布培養液，以照射劑量為6 Gy干預后，繼續培養24 h，然后收集細胞。75%冰乙醇固定，在4℃固定24 h，去固定液，PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。上述實驗重復3次。

1.7 Western blot法檢測Akt、pAkt表達

按上述實驗分組，對照組及照射組更換含0.5% DMSO培養液，藥物組和實驗組更換20 μmol/L塞來昔布培養液，以照射劑量為6 Gy干預后，繼續培養24 h，收集細胞。裂解細胞提取總蛋白，BCA法蛋白定量，取40 μg蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉移至已用甲醇激活的硝酸纖維素膜(PVDF)上，封閉液震動封閉1 h，分別加入抗pAkt、Akt、β-actin一抗，37 ℃溫育1 h，洗膜后加入相應二抗37 ℃溫育1 h。暗室中用ECL發光法顯色，曝光，顯影，定影，水洗。以上實驗重復3次。膠片用薄層掃描儀進行灰度掃描，用AlphaImager 2200軟件分析各產物的灰度值，將各灰度值與對應標本β-actin對照的灰度值相比，計算出樣本蛋白相對表達量。

1.8 統計學處理

實驗結果采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。所有數據以均數±標準差()表示。多組間數據比較采用方差分析；兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MTT實驗結果

MTT法檢測發現，不同濃度塞來昔布作用MDA-MB-231細胞24 h后，有明顯的抑制作用，并且呈劑量依賴性。根據藥物效應中效方程式法計算出藥物IC50、IC20分別約為(50.14±2.42) μmol/L、(20.21±1.34) μmol/L。選擇IC2020 μmol/L作為后續實驗濃度。

2.2 克隆形成實驗結果

照射組和實驗組克隆形成后，計算細胞存活分數并通過單擊多靶模型擬合細胞存活曲線(圖1)，計算出Dq、D0、SF2值(表1)?？梢钥闯?，實驗組Dq、D0、SF2明顯低于照射組，且放射增敏比SERD0為1.277，表明塞來昔布對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231具明顯放射增敏作用。

表 1 照射組和實驗組細胞放射生物學參數Tab.1 The radiobiological parameters of the MDA-MB-231 cells after treatment

2.3 FCM檢測細胞凋亡結果

與對照組相比，塞來昔布和單純照射與對照組相比，均能誘導MDA-MB-231細胞凋亡(t=15.49，P＜0.05；t=24.69，P＜0.05)，兩者聯合作用交單純照射組的效果更顯著(t=14.01，P＜0.05) (圖2，表2)，說明塞來昔布能提高MDA-MB-231細胞對放射線的敏感性。

表 2 MDA-MB-231細胞凋亡率的比較Tab.2 Comparison of apoptosis rates in MDA-MB-231cells after treatment

2.4 Western blot法檢測Akt、pAkt表達結果

以β-actin為內參照，Western blot法檢測蛋白質的表達。結果顯示，實驗各組Akt蛋白表達沒有明顯的差異，各組蛋白相對灰度分析差異無統計學意義(P＞0.05)。塞來昔布能抑制pAkt表達，而放射線能提高pAkt表達，兩者聯合使用后pAkt蛋白表達比單純照射組降低。各組pAkt蛋白相對灰度分析差異有統計學意義(P＜0.05，圖3)。

3 討 論

環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin，PG)的限速酶，PG參與機體多種生理及病理過程。COX分為COX-1型和COX-2型。COX-1主要參與體內正常的生理過程。COX-2為誘生表達，在多種惡性腫瘤中高表達，其與腫瘤的發生、發展密切相關［4-5］。塞來昔布是一種高選擇性的COX-2抑制劑，它能通過阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞調亡、阻斷腫瘤介導的免疫抑制表達、抑制腫瘤新血管生成等起到抗腫瘤作用［6-8］。研究還發現，塞來昔布可增強放射線對腫瘤的作用，但其機制尚未清楚，其可能的機制有：降低細胞內前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)水平，去除放射保護、抑制細胞增殖促進凋亡、阻滯于對放射線敏感的細胞周期［9］、抑制DNA損傷的修復［10］、抗血管生成等［11］。PI3K/Akt信號通路在絕大多數人類腫瘤中表達失調，調節著腫瘤細胞的增殖和凋亡，并且與腫瘤的血管形成和侵襲轉移以及對化學耐藥、放療抗拒密切相關［12-13］。但PI3K/Akt信號通路與塞來昔布在腫瘤細胞放射增敏中的作用及機制尚不清楚。

本實驗研究塞來昔布對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞放射線的作用，流式細胞儀檢測結果顯示，塞來昔布能夠明顯提高腫瘤細胞的放射敏感性。克隆形成實驗單擊多靶模型是衡量細胞放射敏感性的最廣泛的方法。本研究克隆形成實驗結果顯示，塞來昔布對MDAMB-231細胞有明顯的放射增敏作用。塞來昔布聯合X線照射組的Dq、D0、SF2較單純照射組均降低，SERD0為1.277。Dq減小，說明細胞存活曲線肩區縮小，放射抗拒性降低；D0減小，SF2降低，放射抗拒性降低，使細胞亞致死損傷修復能力降低從而達到放射增敏的效果。這可能是塞來昔布降低腫瘤細胞的放射抗拒，提高放射敏感性的重要因素。

腫瘤細胞在受到放射線作用于后，細胞內會發生一系列生物化學反應，以修復其受損的結構和功能，恢復腫瘤細胞的克隆源性增殖能力，甚至增強增殖能力，從而使腫瘤細胞對放射線產生抗拒，抑制腫瘤細胞的凋亡或死亡。而細胞的信號轉導通路在這一過程中起了重要的作用。PI3K/Akt信號轉通路是一條重要的信號轉導通路，其在細胞代謝、細胞周期調控、血管生成等方面發揮重要作用［14-15］。Akt又稱蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)是PI3K/Akt信號轉導通路的核心，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)下游最主要的作用靶標，PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase 9、NF-κB、mTOR、Par-4、P21等，從而誘發腫瘤細胞增殖，促進細胞存活［16］。我們實驗發現，實驗各組Akt在蛋白表達水平沒有明顯改變，而塞來昔布組pAkt蛋白明顯低于對照組，說明塞來昔布能夠抑制Akt磷酸化，這與Barnes等［17］研究的塞來昔布能夠抑制COX-2，從而抑制Akt磷酸化一致。而單純放射組提高pAkt蛋白的表達，推測照射后Akt磷酸化可能是細胞對射線損傷的一個早期反應事件，這也可能是腫瘤細胞放射抗拒的重要原因。塞來昔布聯合照射線組pAkt蛋白低于單純照射組，說明塞來昔布具有抑制放射線誘導Akt磷酸化的作用，增強了放射敏感性。

我們的研究提示，放射線可誘導MDAMB-231細胞PI3K/Akt信號轉導通路的活化，提高腫瘤細胞的放射抗拒，塞來昔布則能夠抑制PI3K/Akt信號轉導通路的活化，從而提高了乳腺癌放射敏感性。

［1］Nakata E, Mason KA, Hunter N, et al.Potentiation of tumor response to radiation or chemoradiation by selective cyclooxygenase-2 enzyme inhibitors ［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 58(2): 369-375.

［2］徐曉婷, 周菊英, 俞志英, 等.COX-2表達對腦膠質瘤的放射敏感性和細胞周期的影響 ［J］.中國癌癥雜志, 2007,17(11): 838-842.

［3］Gupta AK, Bakanauskas VJ, Cerniglia GJ, et al.The Ras radiation resistance pathway ［J］.Cancer Res, 2001, 61(10):4278-4282.

［4］王日雄, 施烯, 林學德, 等.COX-2及VEGF蛋白在大鼠乳腺癌骨移植瘤中的表達及意義 ［J］.中國癌癥雜志, 2010,20(5): 348-352.

［5］Gr?sch S, Maier TJ, Schiffmann S, et al.Cyclooxygenase-2(COX-2)-independent anticarcinogenic effects of selective COX-2 inhibitors ［J］.J Natl Cancer Inst, 2006, 98(11):736-747.

［6］高陽, 莊竟.塞來昔布對人胃癌 SGC-7901細胞系VEGF表達的影響 ［J］.山東醫藥, 2009, 49(24): 60-61.

［7］王玲, 張奇, 趙博, 等.塞來昔布通過阻斷NF-кB信號通路誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞周期阻滯的相關研究 ［J］.中國癌癥雜志, 2009, 19(1): 33-28.

［8］熊一峰, 梅金紅, 徐林林, 等.塞來昔布對人膠質瘤 U251細胞增殖及 NF-κB蛋白表達的影響 ［J］.山東醫藥,2010, 50(31): 26-28.

［9］Raju U, Nakata E, Yang P, et al.In vitro enhancement of tumor cell radiosensitivity by a selective inhibitor of cyclooxygenase-2 enzyme: mechanistic considerations ［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002, 54(3):886-894.

［10］Liu W, Chen Y, Wang W, et al.Combination of radiation and celebrex (celecoxib) reduce mammary and lung tumor growth［J］.Am J Clin Oncol, 2003, 26(4): S103-S109.

［11］Kozin SV, Boucher Y, Hicklin DJ, et al.Vascular endothelial growth factor receptor-2-blocking antibody potentiates radiation-induced long-term control of human tumor xenografts ［J］.Cancer Res, 2001, 61(1): 39-44.

［12］Yuan TL, Cantley LC.PI3K pathway alterations in cancer:variations on a theme ［J］.Oncogene, 2008, 27(41): 5497-5510.

［13］Toulany M, Kehlbach R, Rodemann HP, et al.Radiocontrast media affect radiation-induced DNA damage repairin vitroandin vivoby affecting Akt signalling ［J］.Radiother Oncol, 2010, 94(1): 110-116.

［14］姚婷婷, 林仲秋.PI3K/Akt信號傳導通路在婦科腫瘤中的研究進展 ［J］.實用腫瘤雜志, 2008, 23(2): 182-184.

［15］解智慧, 孫秀華, 柯丹, 等.肺癌中PI3K/Akt信號通路對Skp2調控機制的研究 ［J］.山東醫藥, 2010, 50(8): 13-15.

［16］Song G, Ouyang GL, Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival ［J］.J Cell Mol Med,2005, 9(1): 59-71.

［17］Barnes NL, Warnberg F, Farnie G, et al.Cyclooxygenase-2 inhibition: effects on tumour growth, cell cycling and lymphangiogenesis in a xenograft model of breast cancer ［J］.Br J Cancer, 2007, 96(4): 575-582.