甲狀腺乳頭狀癌組織中瘦素的表達與血管生成及轉移的關系

于霄 趙俊軍 王波 李連宏 李平 唐建武 孫雷

1.大連醫科大學中日臨床病理中心，遼寧 大連 116044；

2.大連市中心醫院，遼寧 大連 116033

1994年瘦素(leptin)和ob基因(obese gene)的發現，1995年leptin受體OB-R的成功克隆將leptin這一物質引入人們的視線。隨著對leptin認識的逐漸加深，學者們發現，leptin不僅與肥胖癥有關，也通過不同的信號通路及途徑參與結腸癌、肝癌、口腔鱗癌、宮頸癌等惡性腫瘤進展過程［1-5］。血管生成對腫瘤的發展至關重要，研究表明leptin有促進血管生成的作用［6］。本實驗采用免疫組織化學染色法檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中leptin的表達情況及其與血管生成、淋巴結轉移的關系。

1 資料和方法

1.1 資料來源

收集大連市中心醫院病理科2003—2009年甲狀腺乳頭狀癌組織標本58例(其中已發生淋巴結轉移29例，未發生淋巴結轉移29例)和甲狀腺腺瘤組織標本26例。

1.2 切片及染色

選定標本經常規4%甲醛固定，將其切片，片厚約4 μm，切片經常規脫蠟、水化后，進行HE染色及免疫組織化學染色。

1.3 分組方法

根據病理診斷將標本分為甲狀腺乳頭狀癌組、對照組(癌旁組、甲狀腺腺瘤組)。

1.4 免疫組織化學染色

試劑：兔抗人leptin多克隆抗體ob購自Santa Cruz公司。鼠抗人CD105單克隆抗體和SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學染色步驟按照SP法。

leptin陽性結果判定：參照許良中等［7］的免疫組織化學反應結果的判定標準，綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數的百分比。陽性細胞百分比分為4級：≤5%為0分；＞5%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%為3分。根據顯色程度判定陽性強度：基本不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘，為最后得分。0～1分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(＋)；4～6分為中等陽性(＋＋)；6分以上為強陽性(＋＋＋)。

C D 1 0 5標記微血管，微血管密度(microvessel density，MVD)計數方法為：與背景明顯有別的任何一個被染成棕色的內皮細胞或不管是否有腔的細胞叢均視為單個微血管，分支結構如果未和連續結構中斷應作為一個血管計數，管徑大于8個紅細胞并具有肌層的血管不作為新生微血管，200倍下選取3個MVD高區，在200倍視野下由2名病理醫師采用雙盲法進行計數，結果取均值作為該病例的MVD。

1.5 統計學處理

應用SPSS13.0統計軟件中的χ2檢驗、單因素方差分析和非參數等級相關性(Spearman)檢驗對數據進行分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組中leptin的表達情況

leptin主要表達于甲狀腺乳頭狀癌組織中、腫瘤細胞的胞質內、局部癌組織及周邊組織間質內(圖1)。甲狀腺乳頭狀癌組織leptin表達陽性率為91.38% (已轉移組93.10%，未轉移組89.66%，χ2=10.68，P＜0.05)，顯著高于甲狀腺腺瘤組織(leptin表達陽性率為7.70%，χ2=56.07，P＜0.05)和癌旁組織(leptin表達陽性率為5.17%，χ2=88.94，P＜0.05)。甲狀腺腺瘤組織與癌旁組織之間leptin表達差異無統計學意義(χ2=2.31，P＞0.05) (表1、2 )。

表 1 各組leptin表達陽性分析Tab.1 Statistic analysis of leptin-positive expression in different groups

表 2 甲狀腺乳頭狀癌組leptin表達情況Tab.2 The expression of leptin in thyroid papillary carcinoma group

2.2 各組CD105表達情況以及MVD計數結果

甲狀腺乳頭狀癌轉移組和未轉移組CD105表達如圖2所示。

經單因素方差分析(表3)，甲狀腺乳頭狀癌已轉移組MVD(59.92±18.54)高于未轉移組(22.44±14.50，P=0.000)、腺瘤組(4.18±2.14，P=0.000)和癌旁組(2.03±1.52，P=0.000)；甲狀腺乳頭狀癌未轉移組MVD高于腺瘤組(P=0.005)和癌旁組(P=0.000)；腺瘤組與癌旁組MVD差異無統計學意義(P=0.919)。Spearman相關分析顯示，MVD隨leptin表達的強度增強而增加，兩者呈正相關性(r=0.88，P＜0.05)。

3 討 論

leptin是由ob基因編碼的146個氨基酸組成的多肽激素。leptin在最初的研究中是作為調節機體能量平衡的重要因子，隨后發現leptin與某些惡性腫瘤的進展有關。相關動物實驗提示由于肥胖引起的leptin血漿水平提高可增加黑色素瘤的生長速度［8］。臨床研究表明，循環血中leptin血漿濃度的提高可見于乳腺癌患者、兒童癌癥患者、兒童期急性淋巴細胞白血病患者等［9-12］。甲狀腺乳頭狀癌患者血漿中leptin濃度的明顯升高與本實驗結果中甲狀腺乳頭狀癌組織leptin的高表達一致［13］。此外，結腸癌、胃癌、宮頸癌組織中leptin的表達亦有增強［14-16］。在惡性腫瘤患者體內血漿leptin濃度的升高、局部癌組織leptin的高表達不僅與脂肪的沉積和能量代謝有關，更受關注的效應是改變惡性腫瘤組織局部環境進而通過復雜的機制參與腫瘤的進展。

表 3 各組新生血管密度以及與leptin表達的相關性分析Tab.3 The MVD in different groups and its correlation with leptin expression

一些體外研究證實leptin對于惡性腫瘤細胞的遷移起到促進作用。如leptin可刺激前列腺癌、結腸癌以及甲狀腺癌細胞的遷移［17-19］。遷移對于腫瘤轉移的發生有非常重要的作用。然而leptin并不是直接賦予惡性腫瘤細胞遷移的能力，而是通過使細胞外基質金屬蛋白酶增多、經激活的NF-κB通路誘導整聯蛋白高表達等途徑改變惡性腫瘤組織局部的細胞外基質狀態，從而發揮促進細胞遷移的作用［20-21］。本實驗結果表明甲狀腺乳頭狀癌中，已發生轉移組的leptin表達強度強于未發生轉移組，據此可推測leptin通過復雜的途徑參與了甲狀腺乳頭狀癌組織的轉移過程。

無血管狀態下腫瘤的直徑不超過2～3 mm，因此腫瘤的發展依賴血管的生成。1998年，Sierra-Honigmann MR等［22］發現leptin受體可表達于人類脈管系統及原代培養的人類內皮細胞，內皮細胞作為leptin可作用的靶細胞在其調控下發生分裂增殖。leptin具有激活造血細胞的作用，并特定地調控內皮祖細胞的黏附性及靶向歸巢能力［23-24］。另有研究表明，leptin還可誘導局部組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達［17］。leptin的這些作用均可促進腫瘤組織血管的新生。部分研究已經證實肝癌、前列腺癌組織中leptin及其受體參與腫瘤組織血管的生成［17，25］。本實驗新生血管密度隨著leptin的表達強度的增加而增高，兩者呈正相關性。推測leptin參與了甲狀腺乳頭狀癌組織內血管的生成，為腫瘤的發展提供基礎。

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