MDM2基因SNP309可能與早發(fā)性乳腺癌易感性無(wú)關(guān)：福建病例-對(duì)照研究

宋傳貴 傅芳萌 吳雪英 林舜國(guó) 王川

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350001

早發(fā)性乳腺癌(發(fā)病年齡≤35歲)屬于具有遺傳傾向的乳腺癌人群，易感性基因BRCA1或BRCA2基因的胚系突變只能解釋其中10%的人群［1］，其余的則涉及到眾多低外顯易感基因位點(diǎn)［2］。MDM2基因?yàn)橐职┗騪53的負(fù)性調(diào)控因子，與p53協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期，保持基因組穩(wěn)定性［3］。近年來(lái)有研究表明，MDM2基因的SNP309 (T＞G，rs2279744)可能增加人群的散發(fā)性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。但各研究結(jié)果尚不一致，國(guó)內(nèi)尚無(wú)MDM2基因SNP309單核苷酸多態(tài)性在早發(fā)性乳腺癌(≤35歲)易感性中的作用的研究報(bào)道。為進(jìn)一步明確其可能的易感效應(yīng)，本研究選擇福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌患者為研究對(duì)象，探討MDM2rs2279744多態(tài)性位點(diǎn)基因型的分布及是否可以作為乳腺癌的低外顯率易感基因位點(diǎn)的可能性。

1 資料和方法

1.1 資料來(lái)源

1.1.1 研究對(duì)象

病例為福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2006年1月—2010年6月無(wú)血緣關(guān)系的福建地區(qū)漢族123例原發(fā)性乳腺癌患者，全部經(jīng)組織病理證實(shí)，家族史狀況由病史或調(diào)查表獲得，并最后經(jīng)本人證實(shí)。病例組均為單純?cè)绨l(fā)性乳腺癌患者，無(wú)明顯家族史，發(fā)病年齡≤35歲。入組患者年齡21～35歲，中位年齡31.7歲。平均初潮年齡為(15.0±1.5)歲。對(duì)照組101例為健康女性，年齡20～39歲，中位年齡33.01歲，平均初潮年齡為(14.0±1.6)歲，按年齡與研究對(duì)象配對(duì)(年齡±4歲)入組。年齡以及初潮年齡兩組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023，P＜0.01)。

1.1.2 標(biāo)本

獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血5 mL置于含800 μL酸性枸櫞酸葡萄糖(ACD)抗凝液的試管中備用。

1.1.3 主要試劑和儀器

FlexiGene DNA提取試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，GeneAmp?9700 PCR 系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)，HotStar Taq聚合酶(5 U/μL)及試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，MassARRA YTM Analyzer(美國(guó)Sequenom公司)。

1.2 方法

1.2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法

步驟方法參考文獻(xiàn)［6-7］(與深圳華大基因組研究中心合作完成)：⑴DNA提取 從外周血提取基因組DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＂芇CR擴(kuò)增 引物如下：1st-PCRP：5’-ACGTTGGATGAGTTCAGGGTAA AGGTCACG-3’，2nd-PCRP：5’-ACGTT GGATGTCACACTAGTGACCCGACAG-3’， UEP序列：5’-GGACCTCCCGCGCCG-3’。PCR反應(yīng)體系總體積為5 μL，其中各種引物濃度為0.1 μmol/L，各種dNTP濃度為0.25 μmol/ L，MgCl2濃度為1 mmol/L，Taq多聚酶(Invitrogen)1.25 U，DNA 模板2.5 ng。PCR反應(yīng)的條件為95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸3 min，然后4 ℃保存。隨后純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系總體積9 μL，PCR純化產(chǎn)物7 μL，延伸混合液2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 min，52 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，55個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸3 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。每個(gè)延伸反應(yīng)用3 mg Clean Resin樹(shù)脂純化后于384孔Specter CHIP芯片上點(diǎn)樣。使用MassARRA YTM Analyzer質(zhì)譜檢測(cè)，運(yùn)行MassARRA YTM Typer 3.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并輸出各樣本相應(yīng)位點(diǎn)的基因型。

1.2.2 基因型的判斷

各樣本經(jīng)PCR反應(yīng)及質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)位點(diǎn)就生成特征性峰值圖，通過(guò)判斷其特征性峰值圖，就可得出其相應(yīng)的堿基。各位點(diǎn)的代表性圖譜見(jiàn)圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行各基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間的分布差異比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗(yàn)；兩組間的流行病學(xué)資料均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)；相對(duì)危險(xiǎn)度采用比值比(odd ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)并應(yīng)用非條件Logistic回歸分析計(jì)算，并對(duì)混雜因素進(jìn)行校正。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例對(duì)照組間流行病學(xué)特征比較

病例組的年齡小于對(duì)照組的年齡，對(duì)照組初潮年齡低于病例組的初潮年齡(P＜0.05)，所以在計(jì)算OR時(shí)需要予以校正。

2.2 基因型鑒定

MDM2基因rs2279744各基因型采用時(shí)間飛行質(zhì)譜分析鑒定(圖1)，結(jié)果共123例病例和101例對(duì)照PCR成功進(jìn)行分型。

2.3 MDM2基因SNP309 基因型分布

正常對(duì)照組中MDM2基因rs2279744 TT、TG及GG基因型的頻率分別為28(27.7%)、50(49.5%)和23(22.8%)；經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，均符合遺傳平衡(P＞0.05)，表明其具有群體代表性。病例組rs2279744 TT、TG及GG基因型的頻率分別為26(21.1%)、61(49.6%)和36(29.3%)，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.389，表1)。

2.4 SNP309基因型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

分別以rs2279744 TT基因型為參照，非條件Logistic回歸分析結(jié)果提示，不管TG ［1.216(95%CI：0.604～2.445)］或是GG［1.326(95%CI：0.869～2.024)］還是TG+GG［1.358(95%CI：0.706～2.614)］都提高了患乳腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)，但差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

3 討 論

MDM2基因?yàn)閜53的上游基因，可以負(fù)性抑制p53基因抑癌功能的表達(dá)，SNP309 (T＞G)為功能性多態(tài)，位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，可以上調(diào)MDM2蛋白表達(dá)，從而抑制p53及其下游通路的抑癌功能，某些研究表明T＞G的轉(zhuǎn)換增加了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在江蘇人群的研究中，Ma等［5］的研究中605例對(duì)照中MDM2基因各基因型的頻率結(jié)果(TT 24%、TG 50.9%、GG 25.1%)與本研究101例對(duì)照的結(jié)果相似(TT 27.7%、TG 49.5%、GG 22.8%)，其中，GG基因型比例明顯低于新加坡人群(44例對(duì)照，34.1%)［4］；說(shuō)明中國(guó)大陸人群與新加坡的華裔人群的地域特征和遺傳特征已有不同。Logistic回歸分析表明，本研究MDM2基因的多態(tài)性位點(diǎn)SNP309(GGvsTT或GG+TGvsTT)在病例組中的分布相對(duì)于對(duì)照人群有增高趨勢(shì)，但都未顯著性的提高早發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這與在散發(fā)性乳腺癌的研究基本相似［5,8］，表明該多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)乳腺癌的易感效應(yīng)相對(duì)微弱。相對(duì)于上海人群中進(jìn)行的乳腺癌研究，Lum等［4］發(fā)現(xiàn)MDM2基因的SNP309 G等位基因增加總體乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)達(dá)2.68 (1.54～4.69)倍；但是在早發(fā)性散發(fā)性乳腺癌(＜40歲)亞組中，SNP309多態(tài)性G基因型對(duì)乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為1.53 (0.68～3.45)，這與本研究結(jié)果相似，說(shuō)明在早發(fā)乳腺癌人群中SNP309的效應(yīng)作用較小，可被其他易感基因所掩蓋。

表 1 MDM2 SNP309多態(tài)性基因型分布及其與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Tab.1 Genotype distribution of SNP 309 of MDM2 gene and its association with risk of breast cancer

我們的研究與前面的研究不同之處在于，本研究的例數(shù)相比散發(fā)乳腺癌人群要少，可能存在著選擇偏差，但由于我們的研究對(duì)象為具有遺傳傾向的早發(fā)性乳腺癌(發(fā)病年齡≤35歲)，更能體現(xiàn)基因的易感效應(yīng)，所以偏差可以得到一定程度的糾正。對(duì)比在中國(guó)臺(tái)灣的散發(fā)性乳腺癌研究(124病例，平均年齡54歲；97例對(duì)照，平均年齡38歲)，本研究(123病例，平均年齡31.78歲；101例對(duì)照，平均年齡33.01歲)的結(jié)果值得探討［9］。

從遺傳基因組學(xué)分析，MDM2基因SNP309多態(tài)性位點(diǎn)可以影響基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，但其實(shí)際的遺傳學(xué)效應(yīng)尚不明確；其二是否其潛在影響被其他未鑒定的相對(duì)高外顯易感基因位點(diǎn)所覆蓋尚需考證。

總之，本研究結(jié)果認(rèn)為，MDM2基因SNP309多態(tài)性在中國(guó)大陸人群中有其自身的分布特點(diǎn)，可能與福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌(≤35歲)的遺傳易感性無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，尚不能作為低外顯率的乳腺癌易感基因位點(diǎn)。明確MDM2基因遺傳多態(tài)性位點(diǎn)在中國(guó)人群中的確切作用，還需要更大樣本的遺傳傾向乳腺癌的流行病學(xué)研究確認(rèn)。

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