結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的對(duì)比研究

吳共發(fā) 胡潔 王雅娟 趙海燕 韓慧霞

1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 廣州 510515；

2桂林市人民醫(yī)院病理科，廣西壯族自治區(qū) 桂林 514002

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。已有大量研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，能夠發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞的EMT特征往往較明顯。但有文獻(xiàn)報(bào)道，能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的并不是EMT細(xì)胞而是非EMT細(xì)胞，EMT細(xì)胞只是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞周圍基質(zhì)，為非EMT細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移開路，最終能在遠(yuǎn)處部位定植的是非EMT細(xì)胞［1］。本研究旨在探討結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620的EMT特征差異，期望進(jìn)一步了解EMT在結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料和方法

1.1 材料

濃縮型鼠抗人E-cadherin、vimentin單克隆抗體、即用型二步法(PV9000)免疫組化廣譜檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自萊德爾生物公司；新生牛血清購(gòu)自吉泰公司；TRIzol試劑購(gòu)自南京凱基公司；Reverse transcription system試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；E-cadherin、vimentin和GAPDH引物由上海英駿公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，采用含20%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中E-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)

參照說明書，用 TRIzol試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體系為20 μL，其中樣品總RNA 2 μL，5×Prime Script 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，Random 6mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC水11 μL。37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 s。 看家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照。通過熒光染料相對(duì)熒光定量PCR方法，同時(shí)對(duì)E-cadherin，vimentin和GAPDH進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出不同樣本的E-cadherin，vimentin的相對(duì)表達(dá)量。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，E-cadherin的上游引物為5’-CGGTGGTCAAAGAGCCCTTA-3’，下游引物為5’-TGAGGGTTGGTGCAACGTCGTTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為170 bp；vimentin的上游引物為5’-TGAGTACCGGAGACAGGTCGAG-3’，下游引物5’-TAGCAGCTTCAACGCAAAGTTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為119 bp；GAPDH上游引物為5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游引物為5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)為259 bp。應(yīng)用Mx3000P定量PCR儀(Stratagene)進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以Folds=2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)比關(guān)系，公式如下ΔΔCt=［Ct(target gene)-Ct(GAPDH)］實(shí)驗(yàn)組-［Ct(target gene)-Ct(GAPDH)］對(duì)照組［2］。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值。

1.2.3 免疫組化方法檢測(cè)E-cadherin和vimentin的表達(dá)

30例配對(duì)標(biāo)本取自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科2007年1月1日—2008年3月1日存檔的結(jié)直腸癌組織蠟塊，每例配對(duì)組織均來自同一患者包括原發(fā)結(jié)直腸癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，患者年齡36～85歲，平均58歲。所有組織均用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片做免疫組化檢測(cè)。

免疫組化方法按照試劑盒說明書操作。E-cadherin和vimentin抗體的工作濃度均為1∶50，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。PBS取代一抗作陰性對(duì)照。E-cadherin在細(xì)胞膜及少許細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，僅有胞質(zhì)著色視為陰性，按染色強(qiáng)度及范圍分為4級(jí)：切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～＜50%為(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～＜90%為(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞90%為(+++)，(+++)視為表達(dá)正常，其他異質(zhì)性表達(dá)均視為表達(dá)異常。vimentin 細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，按染色強(qiáng)度及范圍分為4級(jí)：切片無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～＜10%為(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為(+++)。

1.2.4 HE染色觀察結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織形態(tài)

30例配對(duì)標(biāo)本同1.2.3，組織蠟塊3 μm厚切片，常規(guī)HE染色，采取單盲法由2位初級(jí)病理醫(yī)師初步比較，最后由1位高級(jí)職稱病理醫(yī)師審核，光鏡下觀察比較結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織形態(tài)。

1.2.5 HE染色觀察SW48、SW620細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次，每次30 s，95%乙醇固定15 min，PBS洗滌3次，每次30 s，蘇木精染色3 min，分化數(shù)秒，自來水泡20 min返藍(lán)，伊紅1 min，梯度乙醇脫水，每次2 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較應(yīng)用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩組間比較應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E-cadherin和vimentin在兩細(xì)胞系的表達(dá)

細(xì)胞總mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測(cè)。通過對(duì)獲得的樣本Ct值進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW620E-cadherin mRNA的表達(dá)是SW480的3.18倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.087，P=0.037)。SW620 vimentin mRNA的表達(dá)水平是SW480的6.08倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.087，P=0.037，圖1)。

2.2 E-cadherin、vimentin在結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)

E-cadherin、vimentin在結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.082，P=0.108；χ2=1.597，P=0.660；表1，圖2)。在部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者中E-cadherin的表達(dá)高于結(jié)直腸癌(4/30)，且vimentin表達(dá)比結(jié)直腸癌弱，甚至呈表達(dá)缺失(6/30；圖3)。

2.3 組織形態(tài)

結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織形態(tài)具有相似性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的分化程度并不比原發(fā)癌差，兩者癌細(xì)胞形態(tài)較類似(圖4)。

2.4 細(xì)胞分布

光鏡觀察SW480和SW620細(xì)胞分布與排列類似，兩者均以纖維母樣細(xì)胞和有核仁類圓形細(xì)胞為主，見散在瘤巨細(xì)胞分布，兩者形態(tài)較類似。

表 1 E-cadherin及vimentin在結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況Tab.1 E-cadherin and vimentin expressions in primary colorectal carcinoma and colorectal carcinoma with lymphatic metastasis

3 討 論

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，細(xì)胞間的黏附和相互作用減少，而細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)的能力增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生了改變，喪失了上皮表型，如Cytokeratin和E-cadherin表達(dá)的逐漸降低，而獲得間質(zhì)表型，如vimentin、Fibronectin及α-SMA的表達(dá)等。E-cadherin表達(dá)的丟失被認(rèn)為是EMT最顯著的特征之一［3-4］。EMT最初發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育過程中如原腸胚形成，腎器官發(fā)育及神經(jīng)嵴形成［5］。通過大量的研究，EMT被認(rèn)為是腫瘤演進(jìn)及轉(zhuǎn)移的基本過程，是低侵襲性腫瘤向高侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)換所必需的［6］。但這一普遍被認(rèn)可的觀點(diǎn)近年來卻受到了質(zhì)疑，一個(gè)最主要的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤缺少EMT作用的佐證就是原發(fā)性腫瘤與其轉(zhuǎn)移性腫瘤具有組織病理學(xué)相似性。為了解釋這個(gè)明顯的矛盾，在轉(zhuǎn)移部位的MET作為一個(gè)假設(shè)在轉(zhuǎn)移性腫瘤形成過程中被提了出來［7］。根據(jù)這個(gè)假設(shè)，發(fā)生EMT的細(xì)胞改變它們的黏附性及激活蛋白質(zhì)分解而具備移動(dòng)性，允許它們離開原發(fā)腫瘤，在遠(yuǎn)處部位發(fā)生繼發(fā)腫瘤［8］。在遠(yuǎn)處部位定植過程中，一個(gè)逆轉(zhuǎn)的過程——MET發(fā)生了，轉(zhuǎn)移性腫瘤重新獲得了上皮表型［9］。MET的假設(shè)可以很好地解釋原發(fā)性腫瘤與其轉(zhuǎn)移性腫瘤為何具有組織病理學(xué)相似性，而且E-cadherin在腫瘤進(jìn)展過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)也已經(jīng)有研究記錄。但對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，EMT的發(fā)生至今仍然缺乏直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)［10-11］。

結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的E-cadherin或vimentin的免疫組化檢測(cè)已有報(bào)道［12-13］，但原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌并非都來自同一患者。我們選取的30例結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織為配對(duì)樣本，每對(duì)樣本均來自同一患者，這樣的設(shè)計(jì)更具可比性和嚴(yán)謹(jǐn)性。在我們前期研究中，已經(jīng)對(duì)這30例配對(duì)的結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)其SNAI1的表達(dá)，得出結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的SNAI1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14］。而SNAI1也是發(fā)生EMT的細(xì)胞獲得的標(biāo)志物之一［15］。

我們還采用Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480和SW620的E-cadherin和vimentin的mRNA的表達(dá)。這兩種細(xì)胞系來自同一親本，遺傳背景一致，分別具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SW480與SW620中E-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均以后者為高(P=0.037)。通過HE染色觀察這兩種細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)SW480和SW620均以伸長(zhǎng)的纖維母樣細(xì)胞和有核仁類圓形細(xì)胞為主，兩者形態(tài)較類似，這符合余力等［16］的研究結(jié)果。伸長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)是EMT細(xì)胞的形態(tài)特征之一［17］。單從形態(tài)上分析，SW480和SW620均具有EMT和非EMT的形態(tài)特征，這進(jìn)一步證實(shí)了上述的推測(cè)。

通過本研究及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)結(jié)直腸癌中，發(fā)生了EMT的癌細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力，使它們能夠離開原發(fā)灶在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定植，在遠(yuǎn)處部位定植后，部分癌細(xì)胞發(fā)生MET，重新獲得上皮表型，部分癌細(xì)胞仍保留EMT特征，所以原發(fā)癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的EMT特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而部分癌細(xì)胞保留EMT特征可能是更遠(yuǎn)部位發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因，但這需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持。

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