結直腸癌原發及轉移灶中PI3K、p-Akt及mTOR的表達及意義

肖秀英 于寶華 王麗莎 倪淑娟 楊曉燕 朱玉芬

1.上海市徐匯區中心醫院腫瘤科，上海 200031；

2.復旦大學附屬腫瘤醫院病理科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

近年來，隨著人們生活水平的提高及生活習慣的改變，結直腸癌的發病率呈逐年上升的趨勢。腫瘤的浸潤與轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征，也是結直腸癌患者死亡的主要原因。作為細胞生長、增殖和抗凋亡的重要調節通路——PI3K/Akt信號轉導在結直腸癌轉移中的作用仍未完全闡明［1］。本研究采用免疫組化EnVison法同時檢測結直腸癌原發灶及其相應轉移灶組織中PI3K、p-Akt及mTOR的表達，探討它們在結直腸癌轉移中的作用及其潛在的臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 資料

收集上海市徐匯區中心醫院2007—2008年手術切除的結直腸癌原發灶及相應的轉移灶標本各60例，均經病理證實為腺癌，術前均未接受放療、化療及免疫治療。其中，男性33例，女性27例；年齡24～78歲，中位年齡52歲；發病部位結腸26例，直腸34例；肝轉移灶2例，淋巴結轉移病灶58例。根據WHO腫瘤組織學分類，高分化腺癌4例，中分化腺癌34例，低分化腺癌22例。另選10例癌旁正常結腸黏膜組織作對照。

1.2 組織標本的制備

將結直腸癌原發灶和轉移灶組織蠟塊標本收齊后制備成厚5μm連續切片，每塊組織的連續切片中，均取一張做HE染色對照。

1.3 免疫組化檢測

采用EnVision兩步法，操作步驟嚴格按照說明書進行。PI3K(p110α)、p-Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)購于Cell Signal公司，均為兔抗人濃縮型單克隆抗體，工作濃度依次為1∶100、1∶50、1∶50。EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術開發公司。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。切片脫蠟入水后，于95 ℃～98 ℃檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.0±0.1)中水浴修復15 min，自然冷卻至室溫(約25℃)。擦干切片周圍水分，3% H2O2室溫溫育10 min，TBS沖洗3次，每次5 min，加入一抗工作液4 ℃過夜，TBS漂洗3次，每次5 min，加入HRP標記的二抗，37 ℃下溫育45 min，TBS漂洗3次，每次5 min，DAB室溫下顯色，鏡下控制反應時間，充分沖洗中止反應。蘇木精復染胞核，染色1 min，1%鹽酸乙醇分色3 s，脫水透明、封片。

1.4 結果判斷

［2］方法觀察PI3K蛋白的分布和陽性率。PI3K和p-Akt均為細胞質內表達，mTOR在細胞核及細胞質中均表達，鏡下觀察腫瘤細胞膜或細胞質出現棕黃色或褐色顆粒，染色明顯高于背景為陽性。陽性判讀標準：染色定位于細胞膜及細胞質均為陽性，未見陽性腫瘤細胞者為0分，陽性腫瘤細胞數＜10%者為1分，陽性腫瘤細胞數≥10%者為2分。0分和1分均視為陰性，2分視為陽性。

1.5 統計學處理

采用χ2檢驗和四格表的精確概率法，用統計軟件SPSS 11.5對各指標表達結果進行統計學處理，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 結直腸癌原發及轉移灶組織中PI3K的表達

PI3K蛋白主要定位于細胞質，鏡下癌細胞胞質內出現棕黃色顆粒，同一患者原發及轉移灶表達見圖1A、B。本組60例結直腸癌原發及轉移灶組織中，PI3K陽性率分別為30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；轉移灶陽性率高于原發灶，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)，表明結直腸癌癌細胞轉移后PI3K表達能力增加(表1)。

2.2 結直腸癌原發及轉移灶組織中p-Akt的表達

p-Akt主要定位于細胞質，癌細胞胞質內出現棕黃色顆粒(圖2A、B)。60例結直腸癌原發及轉移灶組織中，p-Akt的陽性率分別為53.3%(32/60)和50.0%(30/60)，兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)，表明結直腸癌轉移前后癌細胞p-Akt的表達無變化(表1)。10例癌旁正常黏膜陽性率為20.0%(2/10)。

2.3 結直腸癌原發灶及轉移灶組織中mTOR表達

mTOR主要定位于細胞質，癌細胞胞質內出現棕黃色顆粒(圖3A、B)。60例結直腸癌原發及轉移灶組織中，mTOR的陽性率分別為41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)，表明結直腸癌轉移后癌細胞mTOR的表達增強(表1)。此外，本組結直腸癌組織中PI3K和mTOR的表達與其分化程度、患者年齡、性別、發生部位均無關(P＞0.05)。

3 討 論

PI3K是一類特異性磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶，稱為PI3Ks家族。依據PI3Ks結構和底物的特異性不同，將PI3Ks分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［3］。Ⅰ型又可分ⅠA和ⅠB兩個亞型，受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活化ⅠA型PI3Ks，G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor，GPCR)活化ⅠB型PI3Ks。其中Ⅰ型PI3Ks是由催化亞基p110和調節亞基p85構成的異二聚體，在腫瘤的發生、發展中起重要作用［4］。活化的PI3K可使磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇4-磷酸(PI-4-P)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphate idylinositol-4，5-bisphosphate，PI-4，5-P2)肌醇環的第3位發生磷酸化，產生磷酸化磷酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphate idylinositol-3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5-P3)［5］。目前認為PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3是細胞內新型的第二信使，與胞質內含有血小板-白細胞C激酶同源(pleckstrin homology，PH)區的信號分子結合后發揮活性調節作用。在本組60例結直腸癌原發及轉移灶組織中， PI3K陽性率分別為30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；轉移灶陽性率高于原發灶，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)，表明結直腸癌癌細胞轉移后PI3K表達能力增加，提示PI3K與結直腸癌的發生、發展有關，其機制可能是通過促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡來實現。有研究表明，抑制PI3K活性可促進加工caspase-3的蛋白酶活化或增加caspase-3對該蛋白酶的敏感性， 因此PI3K可能通過抑制caspase-3活化來發揮抗凋亡作用［6］。

Akt即蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種相對分子質量為57×103的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、PI3K的下游分子，與致小鼠白血病的病毒癌基因v-Akt高度同源，故名Akt。因其激酶活性區的氨基酸序列與蛋白激酶A和蛋白激酶C高度相似，故稱PKB。通過PH區和PIP3結合，通過磷脂酰肌醇依賴性激酶1，2(PDK1、PDK2)使其第308位上的蘇氨酸位點(Thr308)和第473位上的絲氨酸位點(Ser473)磷酸化而被激活［7］。目前主要認為Akt介導體內PI3K依賴的細胞黏附、運動、侵襲和轉移效應。本研究發現，Akt的表達在結直腸癌原發灶及轉移灶中無差別，提示Akt在結直腸癌的轉移過程中變化不明顯，可能是結直腸發生過程中的早期事件。隨后我們檢測了10例癌旁正常黏膜Akt的表達情況，結果陽性率為20.0%，表明Akt可能在結直腸癌的發生早期發揮重要作用，這與以往研究結果一致［8］。近來也有學者報道，應用免疫組化的方法發現在結直腸癌中Akt陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜，與本報道結果一致［9］。但湯建民等［10］報道，在非小細胞肺癌組織中磷酸化Akt表達增加，與腫瘤組織分化程度、臨床分期以及有無淋巴結和遠處轉移相關。因此，結直腸癌組織中Akt的表達與腫瘤是否轉移存在確切關系，可能需要擴大樣本量進一步深入研究。

表 1 結直腸癌原發及轉移灶組織中PI3K、p-Akt、mTOR的表達Tab.1 Expression of PI3K, p-Akt and mTOR in colorectal carcinoma and its metastasis spots

雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1991年被發現的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Akt下游的一個重要靶基因，屬于PIKKS家族(包括DNA-PK、ATM、ATR和MG-1)。由于其羧基末端與PI3K催化區高度同源，被認為是PI3K相關的蛋白激酶家族成員。在哺乳動物中存在序列保守的TOR基因，稱之為mTOR。活化的PI3K/Akt通過TSC1/2復合物進一步激活其下游分子mTOR。mTOR能夠磷酸化它的2個下游分子，即翻譯抑制分子eIF4E結合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein，4EBP1)和核糖體蛋白p70S6K(ribosomal70S 6 kinase，RSK)［11］。4EBP1磷酸化后失活，降低了與eIF4E的結合能力，解除了eIF4E和4EBP1之間的相互作用，使eIF4E與之分離，并與其他翻譯起始因子結合，從而啟動蛋白質的翻譯。而pS6K磷酸化后激活其功能，增加了cyclinD1、CDK4、CDC25A和Rb磷酸化的表達，促進蛋白質的合成［12］。在本研究60例結直腸癌原發及轉移灶組織中，mTOR的陽性率分別為41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)，表明結直腸癌轉移后癌細胞mTOR的表達增強。這與項洪剛等［13］研究的結直腸癌組織中mTOR的陽性率42.2%相一致。

總之，PI3K和mTOR在結直腸癌組織高表達，且在轉移灶的陽性率較原發灶高，將有助于加深對結直腸癌發生、發展機制的理解，為結直腸癌的基因治療和藥物治療提供了一定的分子生物學依據。

［參 考 文 獻］

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