杞菊滴眼液治療實驗性干眼癥淚液減少和角膜上皮病變

劉宏偉 彭淑玲 周 毅 張士賢 張海娟

干眼癥是眼科門診的常見病和多發病，臨床上主要采用物理治療、局部藥物治療、手術治療和全身藥物治療等，一般來說不能將其治愈，只能緩解臨床癥狀。杞菊地黃丸出自清代董西園的《醫級寶鑒》，用于治療肝腎陰不足引起的兩眼昏花、視物模糊、眼睛干澀等，是在六味地黃丸的基礎上加枸杞子和菊花2味中藥而成。枸杞子和菊花有補肝腎，明目的作用。我們受此方劑的啟發，研制出杞菊滴眼液，它由枸杞子、野菊花、黃精和薄荷腦4味藥組成，我們對其促進家兔淚液分泌、減輕大鼠角膜損傷的作用進行實驗研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

家兔20只，為新西蘭兔，普通級動物，體重（2.1±0.3） kg，兔齡為 8 周，動物合格證號：SYXK（京）2006-0025。大鼠40只，為Wister大鼠，無特殊病原體級動物，體重（151±13） g，鼠齡為 6 周，動物合格證號：SYXK（京）2008-0021。均購自北京大學醫學部實驗動物科學部。

1.2 實驗藥品

1.2.1 實驗藥品：杞菊滴眼液、溶劑對照品（北京宏泰康達醫藥科技有限公司）；0.2%卡波姆滴眼液（博士倫公司）；0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液（愛力根愛爾蘭制藥公司）；0.5 mg/ml阿托品注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；1%苯扎溴銨溶液（5%苯扎溴銨溶液加生理鹽水稀釋）、2%熒光素鈉溶液（北京同仁醫院）、0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥株式會社）。

1.2.2 杞菊滴眼液的制備：枸杞子、黃精加80%的乙醇回流2次，濾過；藥渣與野菊花混合，加水浸泡24 h，煎煮3次，濾過，得藥液一；另取薄荷腦、0.5 g吐溫-80，加水適量，研磨使溶解，為藥液二；將藥液一、二混勻，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液、8.5 g氯化鈉，加水至1 000 ml，高壓濕熱滅菌，濾過，灌裝，即得。

1.2.3 溶劑的制備：取0.5g吐溫-80，加水適量，研磨，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液、8.5 g氯化鈉，加水至1 000 ml，高壓濕熱滅菌，濾過，灌裝，即得。

1.3 實驗材料

schirmer測定濾紙、無菌注射器、秒表（schirmer試驗測定時間用）、手術鑷、手術剪、裂隙燈顯微鏡。

1.4 觀察杞菊滴眼液對干眼癥家兔淚液分泌的影響

1.4.1 制作動物模型：參照Burgalassi淚腺注射阿托品的方法進行淚液分泌低下干眼癥的造模〔1〕。20只家兔雙眼滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，下淚腺注射阿托品 0.25 ml/眼（0.5 mg/ml），0.5 小時后進行schirmer試驗，結果較造模前減少（P＜0.05），說明造模成功。予每日雙眼下淚腺注射阿托品4次，連續7天。

1.4.2 分組治療：將20只家兔按第1次注射阿托品后schirmer試驗結果分為5組，每組4只，使各組的schirmer試驗值基本相同，分組后即刻進行治療。5組分別為溶劑對照組（陰性對照）、卡波姆滴眼液組（陽性對照）、杞菊滴眼液低、中、高劑量組。分組后雙眼即刻予相應滴眼劑。溶劑對照組予溶劑，4次/日；卡波姆滴眼液組予0.2%卡波姆滴眼液，2次/日；杞菊滴眼液低劑量組予杞菊滴眼液，2次/日；中劑量組予杞菊滴眼液，4次/日；高劑量組予杞菊滴眼液，8次/日。共治療7天。

1.4.3 淚液分泌的測量：schirmer試驗測定時間為2分鐘。在造模前、第1次注射阿托品后0.5小時、第3、7天當日第 1次注射阿托品后 0.5小時進行schirmer試驗。

1.5 觀察杞菊滴眼液對干眼癥大鼠角膜的作用

1.5.1 制作動物模型：用摘除淚腺、滴加苯扎溴銨溶液的方法制備大鼠角膜損傷干眼癥模型。大鼠耳前皮膚去毛、消毒，滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，用手術鑷夾住耳前皮膚，手術剪在皮膚上剪一小口，剝離并摘除雙側淚腺〔2〕，雙眼滴1%苯扎溴銨溶液，第2天觀察角膜情況。

1.5.2 分組治療：將40只大鼠根據角膜染色評分結果分為5組，每組8只，使各組的角膜染色評分值基本相同，5組分別為溶劑對照組（陰性對照）、羧甲基纖維素鈉滴眼液組（陽性對照）、杞菊滴眼液低、中、高劑量組，雙眼予相應滴眼劑治療。其中羧甲基纖維素鈉滴眼液組予0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液，4次/日；其余4組用藥情況同1.4.2。造模后第2天開始用藥，治療21天。

1.5.3 角膜熒光素染色檢查及評分：大鼠雙眼滴2%熒光素鈉溶液，不沖洗，用裂隙燈顯微鏡進行觀察。角膜上皮無染色，0分；染色面積＜25%，1分；染色面積為25%～50%，2分；染色面積為50%～75%，3分；染色面積＞75%，4分。在治療第7、14和21天檢查并記錄角膜病變情況。

1.6 統計學方法

使用SPSS 11軟件對數據進行統計學分析。結果數值以均數±標準差表示。家兔造模前、后schirmer試驗結果比較采用t檢驗；各組家兔不同時期schirmer試驗結果比較，以及各組大鼠不同時期角膜熒光素染色評分的比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 杞菊滴眼液對家兔淚液分泌的影響

造模前家兔的schirmer試驗值為 （8.61±2.95）mm（n=40），第1次注射阿托品后0.5小時減少為（5.17±3.00）mm，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。schirmer試驗值平均減少40.0%，說明淚腺注射阿托品可以抑制家兔淚液分泌。

家兔造模前及第1次注射阿托品后0.5小時，各組間的schirmer試驗值差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后第3天，卡波姆滴眼液組與溶劑對照組相比，Schirmer試驗值增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組間差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后第7天，杞菊滴眼液中、高劑量組Schirmer試驗值均較溶劑對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組干眼癥家兔眼 Schirmer試驗結果（mm，±s，n=8）

表1 各組干眼癥家兔眼 Schirmer試驗結果（mm，±s，n=8）

注：①造模前及第1次注射阿托品后，各組間比較，P＞0.05；②與溶劑對照組相比P＜0.05；③杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組相比，P＞0.05。

組別 造模前 第1次注射阿托品后 治療3天 治療7天溶劑對照組 8.40±3.67① 5.30±3.40① 3.45±2.25 3.40±2.07卡波姆滴眼液組 7.50±1.84① 5.35±1.75① 5.60±2.13② 6.40±2.41杞菊滴眼液低劑量組 8.00±2.00① 4.85±1.76① 5.20±2.54③ 6.30±1.89③杞菊滴眼液中劑量組 10.50±5.08① 5.35±4.44① 4.80±2.86③ 8.30±5.79②③杞菊滴眼液高劑量組 8.65±2.17① 5.00±3.66① 4.50±1.43③ 8.10±5.51②③

2.2 杞菊滴眼液對大鼠角膜的作用

治療前及治療7天，大鼠各組間角膜染色評分的差異無統計學意義（P＞0.05）；治療14天，杞菊滴眼液低、中、高劑量組的角膜染色評分顯著低于溶劑對照組（P＜0.05）；杞菊滴眼液高劑量組角膜染色評分顯著低于羧甲基纖維素鈉滴眼液組（P＜0.05）；杞菊滴眼液低、中劑量組的角膜染色評分與羧甲基纖維素鈉滴眼液組差異無統計學意義（P＞0.05）；治療21天，杞菊滴眼液低、中、高劑量組和羧甲基纖維素鈉滴眼液組的角膜染色評分均低于溶劑對照組（P＜0.05），杞菊滴眼液各組與羧甲基纖維素鈉滴眼液組差異無統計學意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 大鼠角膜損傷修復的結果（±s，n=16）

表2 大鼠角膜損傷修復的結果（±s，n=16）

注：①各組間相比，P＞0.05；②與溶劑對照組相比，P＜0.05；③與羧甲基纖維素鈉滴眼液組相比，P＜0.05；④與羧甲基纖維素鈉滴眼液組相比，P＞0.05。

組別 治療前 治療7天 治療14天 治療21天溶劑對照組 3.13±1.36① 2.00±1.03① 2.06±0.68 1.38±0.96羧甲基纖維素鈉滴眼液組 3.00±1.10① 2.06±1.18① 1.81±0.91 0.81±0.66②杞菊滴眼液低劑量組 2.94±1.24① 1.63±0.62① 1.44±0.63②④ 0.68±0.60②④杞菊滴眼液中劑量組 3.13±0.96① 1.87±0.72① 1.38±0.50②④ 0.43±0.51②④杞菊滴眼液高劑量組 3.06±0.93① 2.00±0.63① 1.25±0.44②③ 0.56±0.51②④

3 討論

干眼癥患者大多有肝腎陰虛的癥狀，治療原則為“補肝明目”，因此設計使用杞菊滴眼液進行實驗觀察。杞菊滴眼液由4味中藥組成，君藥為枸杞子，主治肝腎陰虛、視力模糊或干澀眼痛，歸肝、腎、肺經，可以滋腎、養肝、明目。臣藥為野菊花，性微寒、味辛、苦，歸肝、心經，清熱解毒。佐藥為黃精，性平、味甘，歸脾、肺、腎經，滋陰潤肺、補脾益氣、滋腎填精，既能補中益氣，又能養陰益精，與枸杞子、野菊花并用，陰陽互根，以滋陰補氣。使藥為薄荷腦，味辛性涼，具有疏風、清熱、解毒等功效。

臨床對干眼癥診斷有多項測定指標，如schirmer試驗、虎紅染色、淚膜破裂時間、瞬目次數、角膜熒光素染色等方法。干眼癥的主要臨床癥狀為淚液分泌減少和角膜上皮損傷，對于實驗性干眼癥的研究，可選一個主要指標研究藥物的有效性和比較不同藥物作用的區別，本實驗采用schirmer試驗和角膜熒光素染色作為觀察指標。

在對滴眼液藥效的研究中，多先固定每日的用量和頻次，檢驗不同濃度藥物的效果，最終確定最佳的藥物濃度。本次實驗中藥物的有效濃度已確定，主要觀察不同頻次對療效的影響。

淚腺，主要由交感和副交感神經支配，是漿液性淚液的主要來源，抑制其作用可減少淚液分泌。Suwanapichon將肉毒毒素注射至大鼠淚腺，使淚液分泌減少〔3〕，大鼠全身注射東莨菪堿也可造成淚液減少〔4〕。兔的淚腺位于眶內，分為上淚腺和下淚腺，上淚腺位于眶內上眶壁內，起于鼻側，止于上眶壁的中部，下淚腺位下眶壁內，起于鼻側，止于顳側。我們將阿托品注射至兔下淚腺的部位，其2分鐘的schirmer平均值由8.61 mm下降為5.17 mm，前后差異有統計學意義（P＜0.05），說明該方法可達到抑制淚液分泌的目的。之后對實驗家兔不斷注射阿托品，使淚液分泌維持在低水平狀態，治療后第7天，杞菊滴眼液中、高劑量組Schirmer試驗值均較溶劑對照組增加（P＜0.05），提示杞菊滴眼液對淚液分泌有促進作用。

大鼠淚腺分為眶內淚腺和眶外淚腺，眶內淚腺是哈德腺（Harderian gland），眶外淚腺是漿液腺，位于耳前皮下。將大鼠的眶外淚腺摘除，可造成淚液分泌減少，Fujihara 等〔2〕報道 schirmer試驗下降 50%，我們的結果是下降60%～80%（另文發表）。淚液分泌減少，角膜可出現潰瘍〔5〕，但角膜潰瘍一般出現在干眼癥的后期。我們在摘除大鼠淚腺后，使用苯扎溴銨溶液造成大鼠角膜損傷，模擬干眼癥的上皮病變。由于淚腺摘除，使角膜上皮的修復延遲，有利于藥物治療作用的觀察。我們的實驗結果顯示，杞菊滴眼液治療14天和21天后，各劑量組大鼠角膜染色評分均低于溶劑對照組（P＜0.05），說明其對角膜上皮修復有促進作用，而角膜上皮修復是干眼癥治療的重要內容〔6〕，考慮其作用與藥物中所含的豐富多糖、脂肪、蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質等有關，它們對組織的修復是有益的。羧甲基纖維素鈉滴眼液對治療角膜上皮損傷也有效，可能由于它的粘稠性使眼表保留部分淚液，而淚液中含有表皮生長因子（EGF）等〔7〕，從而促使角膜上皮修復。

本實驗的結果提示，杞菊滴眼液能增加淚液分泌和促進修復角膜損傷，有利于緩解干眼癥的臨床癥狀，有治療干眼癥的作用，且為中藥制劑，患者可安全地使用。

[1] Burgalassi S，Panichi L，Chetoni P，et al.Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes[J].Ophthalmic Res，1999，31（3）：229-235.

[2] Fujihara T，Murakami T，Fujita H，et al.Improvement of corneal barrier function by the P2Y（2）agonist INS365 in a rat dry eye model[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42（1）：96-100.

[3] Suwan-apichon O，Rizen M，Rangsin R，et al.Botulinum toxin B-induced mouse model of keratoconjunctivitis sicca[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47（1）：133-139.

[4] Viau S，Maire MA，Pasquis B，et al.Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2008，246（6）：857-867.

[5] Nguyen DH，Toshida H，Schurr，et al.Microarray analysis of the rat lacrimal gland following the loss of parasympathetic control of secretion[J].Physiol Genomics，2004，18（1）：108-118.

[6] Higuchi A，Ueno R，Shimmura S，et al.Albumin rescues ocular epithelialcellsfromcelldeathindryeye[J].Curr Eye Res，2007，32（2）：83-88.

[7] Dartt，DA.Interaction of EGF family growth factors and neurotransmitters in regulating lacrimal gland secretion[J].Exp Eye Res，2004，78（3）：337-345.