厲眼蕈蚊高活性Bt菌株的篩選*

張 麗，吳梅香**，羅 佳，張靈玲，黃雪峰，尤梅蘋，范青海

（1.福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

厲眼蕈蚊 （Lycoriella sp.）隸屬于雙翅目 （Diptera）、長角亞目 （Nematocera）、 眼蕈蚊總科 （Sciaroidea）、 眼蕈蚊科 （Sciaridea）， 其中平菇厲眼蕈蚊 （Lycoriella pleuroti Yang et Zhang）是我國危害食用菌的優勢種[1]。厲眼蕈蚊主要以幼蟲取食菌絲、菇蕾以及鉆蛀菌柄進行為害，并能分解菌料中的有效成分，導致菇體萎縮；成蟲雖不取食，但能夠傳播食用菌病害和害螨[2]。目前，食用菌生產上防治厲眼蕈蚊最普遍的方法是化學防治。然而，化學藥劑存在藥劑殘留和害蟲抗藥性等多種副作用，尤其是藥劑殘留問題在生長周期較短的食用菌上尤為突出。物理防治目前還無法有效控制害蟲發生。因此，生物防治愈來愈成為食用菌害蟲防治方法研究的焦點。蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是研究最多、應用最廣的一類殺蟲微生物。由于其分布極廣，且不同菌株間殺蟲譜及殺蟲活性存在差異，因此，通過對各種Bt菌株進行活性測試，篩選對食用菌害蟲具有高活性和特異殺蟲活性的菌株，對將來實施食用菌害蟲的無害化防治具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

供試厲眼蕈蚊采自福州金山福建農林大學菌物研究中心長根菇廢棄菌袋。飼養方法參考王梓清的簡易大量飼養方法[3]，以山藥為替代飼料進行飼養。

1.2 Bt菌株和培養基

1.2.1 Bt菌株

供試的46個菌株，由福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室生物農藥研究室提供。

1.2.2 培養基

LB固體培養基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、 瓊脂粉 17 g， 蒸餾水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分裝后滅菌。

LB液體培養基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g， 蒸餾水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分裝后滅菌。

PM發酵培養基：蛋白胨10 g、酵母膏2 g、KH2PO40.1 g、 FeSO4·7H2O 0.02 g、 ZnSO4·7H2O 0.02 g、 MgSO4·7H2O 0.30 g、 MnSO4·H2O 0.0328 g， 水 1 000 mL， pH 7.0～7.2，分裝后滅菌。

1.3 菌株發酵液制備

在無菌條件下，將保藏的甘油菌按100∶1的接種量接于 5 mL的 LB試管液體培養基中， (30±1)℃、 220 r·min－1搖床培養，24 h后按同樣的接種量轉接于PM發酵培養基中， (30±1)℃、 220 r·min－1搖床培養， 72 h 后進行生測。

1.4 供試Bt菌株胃毒活性測定

參考慕衛韭菜遲眼蕈蚊的生測方法及防治藥劑研究[4]，采用浸漬山藥飼喂法測定供試Bt菌株對厲眼蕈蚊7日～8日齡幼蟲的毒力。將山藥切成大小一致的薄片 （厚約2 mm～3 mm），在Bt發酵液中浸30 min后放入直徑6 cm的培養皿中，培養皿底部放入1層濾紙用以保濕，然后挑入厲眼蕈蚊幼蟲，20頭/皿。以山藥浸入未接菌的PM發酵培養基為對照，每處理重復3次，于25℃、相對濕度85%的條件下飼養，48 h后在顯微鏡下觀察死亡蟲數，計算死亡率和校正死亡率。校正死亡率達50%以上作為初篩有效菌株[5]，之后對初篩有效菌株進行復篩。

1.5 菌株復篩

1.5.1 發酵液原液濃度

用平皿計數法計算初篩有效菌株發酵液原液的活菌數。具體做法：在無菌條件下，將菌株發酵液原液經一系列稀釋，然后用移液器移取10－6的稀釋菌液0.2 mL放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷卻的LB培養基，與菌液混勻，重復4次，冷卻后放入 (30±1)℃恒溫培養箱中，24 h后計數，計算出每毫升菌株發酵液原液的活菌數，計算公式如下：

式中：N1為平皿菌落平均數；n為稀釋倍數。

1.5.2 復篩

在預試的基礎上，分別將初篩有效菌株發酵液原液依次稀釋為5個濃度，然后對不同濃度的菌液進行活性測定，方法同初篩。48 h后開始檢查結果，連續觀察4 d，根據96 h后的觀察結果，采用SPSS17.0軟件進行數據處理，求出毒力回歸方程及LC50。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

將46株Bt菌株分別感染厲眼蕈蚊7日～8日齡幼蟲，48 h后觀察，發現BRC－LLP29和IPS82兩個菌株為初篩有效菌株，校正死亡率分別達到了87.93%和70.21%，見表1。

感染Bt的厲眼蕈蚊幼蟲食欲減退，對毛筆觸動反應遲鈍，有腹瀉現象，死亡后蟲體變暗，輕觸易破。實驗中還發現，剛挑入浸有Bt發酵液的山藥片上的厲眼蕈蚊幼蟲會迅速爬離山藥片，24 h觀察時，大部分幼蟲才會鉆入山藥片中或隱藏于山藥片與濾紙片之間，而對照中挑入的厲眼蕈蚊幼蟲不爬離山藥片。推測可能是因為厲眼蕈蚊幼蟲對部分Bt菌株發酵液本身的氣味有一段適應過程。

表1 厲眼蕈蚊高活性Bt菌株的初步篩選

2.2 復篩結果

對初篩有效菌株BRC－LLP29和IPS82進行室內毒力測定，結果見表2。

表2 厲眼蕈蚊有效Bt菌株的室內毒力測定

從表2得出處理96 h后，BRC－LLP29菌株對厲眼蕈蚊的LC50為 1.182×108cfu·mL－1， IPS82 為 1.977×108cfu·mL－1，由此可見，BRC－LLP29菌株對厲眼蕈蚊的活性高于IPS82菌株。

3 討論

菌株篩選是發現厲眼蕈蚊高活力Bt菌株的重要手段。通過菌株篩選，發現了2株對厲眼蕈蚊幼蟲有高活性的菌株 （IPS82和BRC－LLP29菌株）， 其中BRC－LLP29菌株的活性高于IPS82菌株。IPS82菌株為蘇云金芽孢桿菌以色列亞種，該亞種是第1個被發現對雙翅目蚊蟲有強殺蟲活性的Bt菌株[6]。在食用菌害蟲防治上，國外在上世紀九十年代已有應用Bt菌株防治蘑菇金翅厲眼蕈蚊的研究。1990年，White和Jarret以蘑菇金翅厲眼蕈蚊為試蟲，對IPS82和GC315兩個菌株進行了毒力測定，結果二者的LC50分別為 130 mg·kg－1和 31.4 mg·kg－1， 且田間試驗結果表明GC315的殺蟲效果與化學殺蟲劑除蟲脲相當[7]。White等通過菌株篩選，又發現了對金翅厲眼蕈蚊有活性的GC327菌株，該菌株的殺蟲效果與化學殺蟲劑一樣，而且沒有副作用，因此，對該菌株進行了半商業化試驗[8]。由此可以看出，這兩個菌株的殺蚊效果均已超過了以色列亞種。我國于1979年從國外引進以色列亞種[9]，至今在應用方面也僅限于對水生蚊蟲的防治。

在食用菌害蟲的生物防治研究中，有應用Bt防治食用菌害蟲的嘗試，蔣時察等在Bt菌株對平菇癭蚊的防效試驗中發現，應用生物農藥Bt7216固體菌粉與少量菊酯類農藥復配可以取得較好的防治效果[10]，但該試驗并未說明單獨應用Bt菌株后的防效。本實驗在室內條件下對Bt菌株發酵液進行毒力測定得出的結果，認為BRC-LLP29菌株在濃度較高的情況下對厲眼蕈蚊有較好的控制效果，且其殺蟲效果亦超過了以色列亞種的IPS82菌株。但其作用緩慢，殺蟲速度遠遠比不上吡蟲啉、阿維菌素等化學殺蟲劑。因此，今后應該在菌株基因改造、工程菌構建以及與其他殺蟲劑混配等多個方面進行深入研究，以提高其殺蟲效果，同時，考慮到食用菌是真菌，故有必要在Bt菌株對食用菌生長的影響方面做進一步研究。

[1]張學敏，楊集昆，譚琦.食用菌病蟲害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[2]沈登榮，張宏瑞，張陶.我國食用菌眼蕈蚊的研究現狀[J].中國食用菌，2008，27(1)：48-50.

[3]王梓清，羅佳，王伯明，等.厲眼蕈蚊簡易大量飼養方法[J].中國食用菌，2008，27(5)：52-53.

[4]慕衛，丁中，何茂華，等.韭菜遲眼蕈蚊的生測方法及防治藥劑研究[J].華北農學報， 2002， 17(增刊)： 12-16.

[5]張靈玲，林晶，駱蘭，等.葉面分離Bt及對茶樹主要害蟲高毒力菌株的篩選[J].茶葉科學，2005，25(1)：56-60.

[6]趙新民，夏立秋，王發祥，等.殺蚊蘇云金芽孢桿菌及其晶體蛋白研究進展[J].昆蟲知識，2007，44(3)：337-342.

[7]White PF,Jarret P.Laboratory and field test with Bacillus thuringensis for the control of the mushroom sciarid Lycoriella auripila[C].Brighton Crop Protection Conference:Pests and Diseases,1990.

[8]White PF,Butt J,Pethybndge NJ,et al.The story of a strain:Development of GC327,a dipteran-active strain of Bacillus thuringiensis effective against the mushroom sciarid,Lycoriella auripila science and cultivation of edible fungi[J].The International Society for Mushroom Science,1995,14(2):499-506.

[9]喻子牛.蘇云金桿菌以色列變種在我國的研究[J].華中農學院學報，1982(6)：93-97.

[10]蔣時察，莊燕平.BT防治平菇癭蚊試驗[J].長江蔬菜，1994(1)：20.