靈芝制種過程多糖含量變化研究*

陳永敢，陳光宙，袁學軍，陳忠蔭，林應耀，林熾賢

（瓊州學院生物科學與技術學院，海南 三亞 572022）

靈芝 （Ganoderma spp.）是一種腐生型的真菌，以腐解木材中的木質素作為生長發育的營養基礎。經典分類學研究認為，靈芝隸屬擔子菌門中的擔子菌綱 （Basidiomycetes）、 傘菌亞綱 （Agaricomycetidae）、 多孔菌目（Polyporales）、 靈 芝菌科 （Ganodermataceae）、 靈 芝 屬（Ganoderma）[1]。自古以來，靈芝就被認為是滋補強壯的珍貴藥材，我國古代著名的醫學著作 《本草綱目》等就對其進行了詳細的記載[2，3]。隨著近代生物化學技術的發展，新的研究方法逐漸地運用到靈芝功效研究中來，分析證明了靈芝中含有豐富的營養化學成分，且不同的物質具有不同的臨床功效，最常見的有高分子多糖、三萜化合物、有機鍺、氨基酸、生物堿、蛋白酶及多種肽等，其中功能最顯著且研究最深入的是高分子多糖[4，5]。

通過熱水、CO2超臨界萃取技術，從靈芝中提取出來50多種高分子多糖[6]，這些多糖能抑制增生細胞的形成，具有明顯的免疫調節作用，可以想見在腫瘤生物學和病毒侵染等研究中這類化合物將發揮越來越重要的作用[7]。有研究表明，赤芝多糖有明顯的強心降壓作用，對動脈粥樣硬化有預防和治療作用；靈芝子實體提取出2種聚糖（Ganoderan A、Ganoderan B），經腹腔注入正常小鼠，均能降低血糖[8]?？傊?，隨著生物化學及分析化學技術的發展，靈芝的功效將會越來越多的被揭示出來，同時其應用前景將更加的廣泛。

近年來靈芝 （Ganoderma spp.）的人工栽培已有所推廣，特別是赤芝 （Ganoderma lucidum）的栽培技術已成熟，但人工栽培所必需的制種過程中，靈芝多糖含量變化的研究至今鮮有報道。本研究選取了4株具有重要藥用價值的靈芝，進行栽培制種并研究其多糖含量的變化，對進一步研究人工栽培靈芝藥用價值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及靈芝的制種

供試菌株：Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma lucidum Hz5、 Ganoderma neojaponicum Wzs1、 Ganoderma sinense Hz1四株菌株均為本研究室保存。

靈芝制種：靈芝菌絲接種于PDA培養基表面，于28℃恒溫培養至長出菌落，21 d后形成一級成熟菌絲。將一級成熟菌絲接種到二級培養基 （木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%、水，121℃、0.1 MPa滅菌2 h）上，28℃恒溫避光培養30 d得二級成熟菌絲；將二級成熟菌絲接種到三級培養基 （木屑73%、玉米粉5%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%，121℃、0.1 MPa滅菌2 h）上，28℃恒溫避光培養50 d得三級成熟菌絲。

1.2 靈芝菌絲多糖待測液的制備

已培養成熟的靈芝菌絲65℃恒溫烘干，取0.2 g研磨粉碎并移至試管，加入15 mL 95%的酒精，密閉狀態下78℃水浴 30 min， 3 000 r·min－1離心 30 min， 去除上清，重復2次。取沉淀加入15 mL蒸餾水，密閉狀態下沸水浴1 h， 3 000 r·min－1離心 30 min。 收集上清并定容至 100 mL（菌株 Ganoderma neojaponicum Wzs1定容至 50 mL），搖勻得一級菌絲多糖待測液。二級菌絲上清液定容至50 mL（菌株Ganoderma lucidum Hz5定容至25 mL）、三級菌絲上清液均定容至25 mL，其它提取操作步驟與一級菌絲相同。

1.3 靈芝菌絲多糖含量的測定

適量葡萄糖105℃烘干并取0.5 g，蒸餾水溶解并定容至 50 mL， 從中取出 1 mL 定容至 50 mL， 得到 200 μg·mL－1的葡萄糖溶液，按表1制備葡萄糖標準溶液。0.1 g蒽酮溶于106 mL硫酸溶液中 （硫酸溶液的配制為76 mL濃硫酸加30 mL水）。按表1取葡萄糖溶液和蒸餾水，加入5 mL蒽酮試劑搖勻，沸水浴10 min，再冰水浴10 min，625 nm處測定吸光值。取菌絲多糖待測液1 mL，加入蒽酮試劑5 mL，沸水浴10 min，之后冰水浴10 min，取出于625 nm處測定菌絲多糖溶液的吸光度。葡萄糖標準溶液的制備見表1。

表1 葡萄糖標準溶液的制備

2 結果

2.1 靈芝的制種

將保存的菌株接種到一級培養基上培養21 d后，菌絲完全覆蓋培養基表面，菌絲純白、粗壯、致密，菌落中間略泛黃、，將菌絲轉接到二級種培養基，另挑取部分菌絲進行烘干處理。菌絲在二級培養基上培養30 d菌絲長滿瓶，瓶蓋處菌絲厚實、純白。培養成熟的二級菌絲轉接到三級培養基，并挑取部分菌絲進行烘干處理。菌絲在三級培養基上培養50 d長滿瓶，菌絲粗壯、密集、分布均勻，挑取成熟菌絲進行烘干處理，見圖1。

2.2 制種過程中多糖含量的變化

以蒸餾水為空白，葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到葡萄糖標準曲線回歸方程為：

注：A表示吸光值，C表示葡萄糖濃度。

利用蒽酮－硫酸顯色法在波長為625 nm處，測得4株不同級種的靈芝菌絲吸光值在0.2～0.4之間。制種過程中靈芝菌絲多糖含量變化見圖2。

Hz2、Hz5、Hz1株靈芝真菌在制種過程中多糖含量呈遞減的趨勢，其中菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1較特殊，二級種在制種過程中多糖含量最多為1.75%。在制種的最初階段一級種時，4株靈芝真菌中Ganoderma sinense Hz1多糖含量最大為3.18%，而菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1最少為1.05%；處于完成制種的三級種階段，菌株Ganoderma lucidum Hz5多糖含量最少為0.56%，而菌株 Ganoderma atrum Hz2最大為 0.88%。

3 討論

靈芝真菌制種過程中，一級菌絲到三級菌絲多糖含量總體上呈遞減趨勢，其中一級菌絲到二級菌絲多糖含量的變化較大，二級菌絲到三級菌絲的多糖含量變化較小。一級PDA培養基主要成分為馬鈴薯、葡萄糖，而二級培養基與三級培養基相似，主要成分為木屑，這種成分上的差別可能造成了靈芝制種過程中多糖含量的遞減。二級與三級培養基含糖量較少，不利于菌絲對營養成分的吸收，同時菌絲在生長過程中消耗了菌體內儲存的糖類物質，因此在制種完成階段多糖的含量就比制種之初發生了減少[9]。菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1分離自海南五指山，制種過程中各級菌絲多糖含量并未呈逐級遞減的規律性變化，二級種的含糖量明顯偏高，這種特殊性是產自五指山地區靈芝所具有的特點，還是Ganoderma neojaponicum本身具備的特征，有待進一步的研究。

一級菌絲 Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma sinense Hz1多糖含量較高，而Ganoderma lucidum Hz5多糖含量較低，這可能因為前兩株靈芝菌絲都從野生子實體中分離出來的，未經人工馴化保持了天然的多糖含量，而Hz5已經經過人工馴化。人工栽培的條件下，部分天然的糖分會有所丟失，所以Hz5一級菌絲多糖含量比菌株Hz2和Hz1的一級菌絲的多糖含量少[10]。在制種完成的三級種階段，4株菌株的多糖含量只有較小的差別，但菌株Hz5菌絲的多糖含量較少。因此，完成人工制種的紫芝和黑芝比赤芝的藥用價值高，實現這兩種靈芝的人工栽培將有利于進一步推廣高品質和高藥用價值的靈芝。

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