樹舌液體發酵的培養基優化*

黃達明 ， 李 欣 ， 黃 翀 ， 張志才 ，4**， 孫文敬

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江西省生物發酵食品添加劑工程技術研究中心，江西 上饒 334221；3.南京郵電大學通信與信息工程學院，江蘇 南京 210046；4.北京綠科天成生物有限公司，北京 100089）

在糖尿病的治療方面，目前降血糖的方法大部分是注射胰島素，但這種治療方法大都是短時的，并且易出現多種副作用。葡萄糖的吸收利用包括葡萄糖進入細胞以及葡萄糖在細胞內分解。葡萄糖進入細胞的主要方式是協助擴散，擴散速率受細胞內外葡萄糖濃度差值、擴散系數以及葡萄糖與細胞膜上載體的親和力的影響。提高葡萄糖代謝，降低細胞內葡萄糖濃度有利于提高葡萄糖進入細胞的速率。糖耗量是反映糖代謝速率一個重要指標。肝臟又是機體吸收利用葡萄糖的重要器官之一。對于葡萄糖的消耗，國內外文獻報道大都在細胞水平或體內分子水平上研究，且主要以刺激胰島素分泌和耗氧量作為檢測指標[1-8]，但是這兩個指標不能準確地反應組織代謝水平。

樹舌 （Ganoderma applanatum）屬真菌門 （Eumycota）、擔子菌亞門 （Basidiomycotina）、 層菌綱 （Hymenomycetes)、非菌褶目 (Aphyllophorales)、 靈芝菌科 （Ganodermataceae）、靈芝屬 （Ganoderma），是重要的藥用真菌之一。樹舌主要成分包括多糖、甾體化合物、三萜、脂類、氨基酸以及微量元素等[9，10]。樹舌性平，氣微、味淡[11]，具有清熱、消積、化痰、止痛等功效[12]。作為一種藥用真菌，在人類治療疾病方面發揮著重要作用。隨著對樹舌研究的不斷深入，其藥用價值已引起人們的高度重視。

試驗以糖耗量為指標，對樹舌發酵液提高離體肝臟糖耗量的條件進行了研究，篩選并優化出合適的樹舌發酵條件，試圖研究出其降血糖機理，以期為樹舌大規模工業發酵生產相關降糖產品提供理論支持和科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

樹舌：由中國科學院地球化學研究所連賓老師饋贈，現存于中國農業微生物菌種保藏管理中心，編號AC CC52297。

1.2 培養基

麥麩固體培養基：麥麩15 g，水20 mL；種子培養基：馬鈴薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g，水1 000 mL；基礎培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂 0.5 g、 氯化鉀 0.5 g、 硫酸亞鐵 0.1 g， 水 1 000 mL，自然pH。

1.3 儀器設備

HH－S數顯恒溫水浴鍋 （江蘇金壇醫療儀器廠）；全自動高壓蒸汽滅菌鍋YX－400Z（上海三申醫療器械廠）；PSX智能型恒溫恒濕培養箱 （寧波萊福特科技有限公司）；全控溫恒溫搖床 （YC－W冷凍型，鎮江格瑞生物工程公司）；可見分光光度計7200（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌種培養

將樹舌菌種接種到麥麩固體培養基，30℃培養7 d后，轉接入種子培養基，28℃、150 r·min－1培養 3 d， 以 10%接種量，轉接入發酵培養基，在同樣的條件下培養5 d。

1.4.2 單因素試驗

不同的碳源、氮源、無機鹽、營養因子、pH作為基礎培養基成分。碳源優化分別以20 g·L－1的甘油、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、果糖、微晶纖維素、可溶性淀粉代替基礎培養基中的碳源。氮源優化分別以4 g·L－1的酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素和硝酸鉀代替基礎培養基中的氮源。無機鹽優化分別以0.5 g·L－1的NaCl、 KCl、 CaCl2、 MgCl2、 FeSO4、 Fe2（SO4）3、 ZnCl2、CuSO4、MnCl2代替基礎培養基作為無機鹽。營養因子優化分別以 10 mg·L－1的 VB1、 VB2、 VB6、 VB12、 VC 和 3,5－二硝基水楊酸為營養因子。pH優化分別選擇pH5、pH5.5、pH6、 pH6.5、 pH7、 pH7.5代替自然 pH。 分別比較不同的單因素，篩選出具有高糖耗量發酵液的碳源、氮源、無機鹽、營養因子和pH。

1.4.3 正交試驗設計

為了確定最優的碳源、氮源、無機鹽和營養因子，設計了L18（37）正交試驗，配成18種培養基，在250 mL三角瓶中裝入培養液100 mL，每種設置3個重復，按照10%接種， 28℃、 160 r·min－1培養 5d， 測定糖耗量。

1.4.4 糖耗量測定方法

（1）發酵液的制備

發酵液離心 （4 000 r·min－1， 10 min）， 取上清液備用。

（2）離體肝組織的制備

試驗小鼠 （昆明種雄性小鼠，6周齡，體重18 g～20 g，由江蘇大學醫學院動物實驗中心提供）乙醚麻醉后取肝臟組織， 4℃條件下研磨離心 （4 500 r·min－1， 10 min），取上清液備用。

（3）糖耗量的計算方法

3,5－二硝基水楊酸比色測糖法[13，14]，測定發酵液中的還原糖含量A1。

取 0.5 mL 發酵液， 0.5 mL 肝臟上清液， 加入 pH7.4的 0.2 mol·L－1磷酸鹽緩沖液 1 mL， 同時加入 2%葡萄糖（A0）和10 mg苯甲酸鈉，定容至2 mL混勻。然后37℃水浴48 h后，用3,5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量A2。 糖耗量 （I）計算公式為

式中： A0、 A1、 A2同上。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源對糖耗量的影響

碳源是培養基中的主要成分之一，能被微生物用來構成細胞物質或代謝產物骨架，以及為生物體生命活動提供能量。結果見圖1。

圖1 不同碳源對發酵液糖耗量的影響

從圖1可以看出，以葡萄糖 （對照組）為碳源的發酵液糖耗量最高，為74.87%，其次是甘露醇為碳源的發酵液糖耗量為71.89%。以乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和果糖為碳源的發酵液糖耗量相近，分別為66.33%、66.66%、69.74%、 68.37%、 67.73%。 以微晶纖維素和可溶性淀粉為碳源的發酵液糖耗量都比較低，均低于63%。可見，葡萄糖和甘露醇是較適合的碳源。

2.1.2 氮源對糖耗量的影響

氮源是微生物生長所需要的重要物質，主要用于合成菌體細胞物質 （氨基酸、蛋白質、核酸）和含氮代謝物。不同的微生物所需要的氮源不盡相同。結果見圖2。

硫酸銨和蛋白胨 （對照組）作為氮源的發酵液糖耗量最高，分別為70.75%和71.91%。尿素和硝酸鉀次之，為67.19%和 68.14%。酵母膏作為氮源的效果最差僅為64.08%，顯著低于蛋白胨 （對照組）因此，正交試驗中確定硫酸銨和蛋白胨作為氮源。

圖2 不同氮源對發酵液糖耗量的影響

2.1.3 無機鹽對糖耗量的影響

無機鹽在微生物生長中的主要作用是構成菌體細胞成分，作為輔基、輔酶、抑制劑或激活劑。無機鹽參與機體內酶活性的調節，同時無機鹽還能夠調節培養基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，因此無機鹽在微生物生長代謝過程中起著非常重要的作用。試驗選擇了KCl、NaCl、MgCl2、 ZnCl2、 CaCl2、 MnCl2、 FeSO4、 CuSO4和 Fe2(SO4)3對發酵液糖耗量的影響，并以不加無機鹽作為對照。結果見圖3。

圖3 無機鹽對發酵液糖耗量的影響

從圖3可以看出，添加無機鹽后糖耗量較高的是FeSO4、 KCl、 ZnCl2， 分 別 是 81.49%、 79.22%和 71.87%，均高于對照組 67.77%。 添加 MgCl2、 CaCl2、 NaCl、 Fe2(SO4)3、CuSO4、 MnCl2的發酵液糖耗量分別為 65.67%、 68.12%、65.86%、 67.61%、 56.08%、 59.28%， 均低于對照組。 最終確定FeSO4、KCl、ZnCl2作為正交試驗中的無機鹽。

2.1.4 生長因子對糖耗量的影響

生長因子是體內參與反應催化劑重要輔酶，對酶活性起著調控作用。本試驗選擇了維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C并以不加生長因子的作為對照，測定對發酵液中糖耗量的影響。結果見圖4。

從圖4可以得出，加入不同生長因子的發酵液糖耗量沒有明顯的區別，與對照組的71.91%接近。說明生長因子在試驗中沒有顯著的影響。

2.1.5 pH 對糖耗量的影響

pH對菌絲體代謝的影響表現為對菌體生長的影響和對產物合成的影響，試驗分別選擇 pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、 pH7、 pH7.5， 并以自然 pH 作為對照試驗對發酵液糖耗量的影響。結果見圖5。

不同pH條件下，發酵液糖耗量分別為67.19%、63.81%、 51.78%、 65.22%、 66.66%、 68.97%， 但都低于作為對照的自然pH，為70.67%。因此正交試驗選擇自然pH。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗的結果，選取葡萄糖、甘露醇、蛋白胨、 硫酸銨、 KCl、 FeSO4、 ZnCl2進行正交試驗 L18（37），因素水平見表1，正交試驗結果見表2，確定各組分優化比例。

表1 正交試驗因素水平

正交試驗結果表明，不同組合間發酵液糖耗量不同。各因素對發酵液糖耗量的影響大小依次為葡萄糖＞硫酸亞鐵＞甘露醇＞氯化鋅＞蛋白胨＞硫酸銨＞氯化鉀，其中碳源葡萄糖對發酵液糖耗量的影響最大，無機鹽氯化鉀的影響最小。從糖耗量來考察各因素水平值，最適培養基組合應是葡萄糖 5 g·L－1、 硫酸亞鐵 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化鋅 0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸銨 1 g·L－1、 氯化鉀 0.5 g·L－1。

為了證實試驗結果的可靠性，進行進一步驗證，用上述最佳培養基進行發酵試驗，測得發酵液糖耗量為88.62%。

表2 正交試驗設計及結果分析

3 討論與結論

肝臟是體內各代謝的主要靶器官之一，促進并提高肝臟的葡萄糖消耗量是糖尿病研究的重要課題。在本試驗中，保持離體肝臟的活性是至關重要的。試驗中加入防腐劑來保持離體肝臟的活性不受到體外環境的污染。體外反應48 h后顯微觀察，發現并沒有受到雜菌污染，同時反應中的葡萄糖消耗完全。

本試驗利用樹舌發酵液提高離體肝臟糖耗量，通過單因素試驗和正交試驗得到了最佳優化培養基，即為葡萄糖5 g·L－1、 硫酸亞鐵 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化鋅0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸銨 1 g·L－1、 氯化鉀 0.5 g·L－1。發酵后糖耗量可達到88.62%，顯著高于未優化培養基的74.87%。本試驗表明樹舌發酵液能夠促進離體肝臟內葡萄糖消耗，達到提高糖耗量的作用，是潛在的降糖及治療糖尿病藥物。但其降糖機理及效應還需通過體內試驗研究證實。

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