頭孢拉定與血清白蛋白相互作用的光譜學研究

宋熙熙 陳樹大 劉 濤

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001)

頭孢拉定與血清白蛋白相互作用的光譜學研究

宋熙熙 陳樹大 劉 濤

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001)

采用熒光和紫外吸收光譜法研究頭孢拉定和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。研究發現，頭孢拉定熒光猝滅牛血清白蛋白是由于形成了頭孢拉定-牛血清白蛋白復合物。分別計算了不同溫度下雙分子猝滅常數kq和結合常數K。由熱力學參數焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG)，推斷出頭孢拉定與BSA的相互作用是一個疏水作用的自發過程。

頭孢拉定 牛血清白蛋白 熒光猝滅 熱力學參數

頭孢拉定(分子式C16H19N3O4S)是一種穩定性好、刺激性小，在臨床上廣泛使用的唯一可供口服和注射的頭孢菌素。頭孢拉定毒性低，治療指數大，不良反應少，對腎毒性低，因此在治療和預防多種感染中具有較好的療效。

血清白蛋白是血漿中含量最為豐富的蛋白質，具有貯運內源代謝產物和外源藥物小分子等重要生理功能，對藥物在體內的代謝和分布產生很大影響。筆者選用牛血清白蛋白為蛋白模型，從不同角度考察血清白蛋白與頭孢拉定的相互作用，對闡明頭孢拉定在體內的存儲和轉運過程、血清白蛋白的結構與功能之間的關系以及生物大分子與藥物小分子的相互作用的化學本質具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

分子熒光分光光度計：Gary Eclipse型，美國Varian公司；

紫外分光光度計：UV-2550型，日本島津公司；

頭孢拉定：浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠生產，以pH 7.4 Tris-HCl緩沖液配制成濃度為1.5×10-3mol／L的儲備液；

牛血清白蛋白V(BSA)：北京鼎國生物技術有限責任公司生產，用緩沖液配制成濃度為2.0×10-5mol／L的儲備液，保存于4℃的冰箱中，備用；

NaCl溶液：0.1 mol／L，用以維持溶液離子強度，寧波市化學試劑有限公司；

實驗所用其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

在不同溫度(25、30、37℃)下，采用分子熒光光譜法測定牛血清白蛋白溶液及與不同濃度的頭孢拉定溶液混合后的熒光光譜，分析熒光強度變化的原因。

2 結果與討論

2.1 熒光分析

對BSA預掃描，得到BSA最大激發波長為228 nm，最大發射波長為339 nm。因此以228 nm為激發波長，記錄BSA的熒光光譜及頭孢拉定對BSA的熒光猝滅；以228 nm為激發波長，記錄BSA和含不同濃度頭孢拉定時BSA的發射光譜，結果見圖1。

圖1 不同濃度頭孢拉定的BSA熒光猝滅光譜

2.2 猝滅常數kq

分子間的作用不同可以導致不同的猝滅方式，典型的猝滅方式有動態猝滅和靜態猝滅［1］。為了確定此猝滅過程的機制，先假設頭孢拉定對BSA的熒光猝滅為動態猝滅過程，應服從Stern-Volmer方程：

式中：F0——猝滅體不存在時的熒光強度；

F——加入猝滅體后的熒光強度；

kq——雙分子猝滅常數，L／(mol·s)；

τ0——猝滅體不存在時熒光體的熒光壽命，ns；

c(Q)——猝滅體濃度，mol/L；

kd——Stern-Volmer常數。

實驗測得τ0的值在1～10 ns之間［2］，為了計算方便，一些文獻取τ0為1 ns［3，4］，另有文獻取τ0=l0 ns［5，6］。本實驗取τ0=1 ns。以F0／F-1對c(Q)作圖，得到不同溫度下的kq值，見表1。

表1 不同溫度下BSA與頭孢拉定的雙分子猝滅常數kq(pH 7.4)

由表1可以看出，頭孢拉定與BSA相互作用，在228 nm激發波長下，不同溫度時的雙分子猝滅常數kq遠大于各種猝滅體對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數2.0×1010L/ (mol ·s)［7］，說明此猝滅過程不是由于動態猝滅引起的。隨著頭孢拉定濃度的增加，BSA的熒光強度有不同程度的猝滅，且BSA的熒光峰位沒有發生改變，所以初步確定加入藥物后，BSA的結構基本上沒有發生變化。由此推測，此猝滅過程可能是由于頭孢拉定與BSA形成了締合物而引起的靜態猝滅，也就是說此猝滅過程是由于藥物與BSA在基態時生成了復合物，從而導致BSA的熒光強度猝滅。

2.3 結合常數K和活化能Ea

頭孢拉定和BSA的結合常數較大，形成結合位點，且受溫度影響較大，說明頭孢拉定與BSA有較強的結合作用，可以被蛋白質運輸和儲存。

根據方程［8］：

表2 不同溫度下BSA與頭孢拉定的結合常數K(pH 7.4)

根據阿倫尼烏斯方程lnK=lnA-Ea／RT，可得結合活化能Ea為935.2 kJ／mol ，表示活化分子的平均能量與反應物分子平均能量的差值。溫度升高，體系中分子間的碰撞的幾率增加，BSA與頭孢拉定分子的有效碰撞加劇，活化分子增多。活化能與反應速率的大小有著密切的關系，活化能越小反應速率越大。

2.4 結合距離

根據Forster理論［9,10］，無輻射能量轉移效率E可表示為：

其中R0為轉移效率為50%時的臨界距離，計算公式為：

根據文獻［11］，其中K2=2/3，為空間取向因子，φD為供體的熒光量子產率，φD=0.118，n是介質的折射指數，n=1.336，J為供體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分：

其中FD(λ)為熒光供體在波長為λ時的熒光強度，ε(λ)為受體在波長為λ時的摩爾消光系數。能量轉移效率E還可以表示為：

式中：F——藥物與BSA的濃度比為1∶1時的熒光強度；

F0——未加入藥物時的熒光強度。

根據式(3)～式(6)可以求得在228 nm波長激發下，不同的J，E和r值。以25℃為例：

2.5 熒光猝滅過程中熱力學函數的變化與作用力判斷

藥物等有機小分子和蛋白質等生物大分子之間的結合力主要有疏水作用力、氫鍵作用力、范德華力和靜電引力等。Ross等［12］根據大量實驗規律總結，利用反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小來判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型：ΔH＞0，ΔS＞0時為疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0時為氫鍵和范德華力；ΔH＜0，ΔS＞0時為靜電引力。在溫度變化不大時，反應的ΔH可以看作一個常數。由下列公式可得ΔG、ΔH和ΔS。

應指出BSA結構很復雜，藥物與它之間往往同時存在幾種作用力。根據以上公式求得熒光猝滅實驗中頭孢拉定與BSA結合反應的熱力學函數值見表3。可知熒光猝滅實驗推測出頭孢拉定藥物與BSA之間的主要作用力均為疏水作用力［13,14］。

表3 BSA與頭孢拉定相互作用的熱力學常數及作用力

3 結論

采用分子熒光光譜法研究了生物大分子牛血清白蛋白BSA與藥物小分子頭孢拉定的相互作用，研究結果表明，BSA的熒光峰位置相同，均為343 nm左右，說明了結合過程中BSA的結構基本保持不變，并且隨頭孢拉定濃度的增加，熒光強度不斷減弱，BSA與頭孢拉定分子結合，生成了相應的復合物，導致BSA內源熒光猝滅。由Stern-Volmer方程可到結合作用的雙分子猝滅常數，該猝滅常數遠小于生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數，說明該結合過程是一個靜態猝滅過程，由Linewerver-Burk雙倒數模型，得到不同溫度下BSA與頭孢拉定相互結合的結合常數K，討論了相關的熱力學常數，可知該結合作用是在自發的作用下進行，通過一定的非價鍵力，即分子間疏水作用進行，結合反應速率較快。

［1］楊頻，高飛.生物無機化學原理［M］.北京：科學出版社，2002：331-335.

［2］Lakowicz J R，Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen：a probe for structural fluctuations in macromolecules［J］.Biochemistry，1973，12(21)： 4 161-4 165.

［3］楊斌盛，楊頻.人血清白蛋白與金屬離子作用的熒光光譜研究［J］.生物化學與生物物理進展，1992，19(2)：110-114.

［4］朱鏗，童沈陽.熒光黃與蛋白質相互作用的研究［J］.高等學校化學學報，1996，17(4)： 539-542.

［5］上官云鳳，顏承農，馮志云，等.二苯基(2-氯苯基)甲醇與牛血清白蛋白結合反應特征研究［J］.光譜學與光譜分析，2004，23(6)：32-35.

［6］姚武，高峰，王倫.依諾沙星與牛血清白蛋白相互作用的熒光法研究［J］.分析測試學報，2005，24(1)： 76-82.

［7］Elo Ware W R. Oxygen quenching of fluorescence in solution： an experimental study of the diffusion process［J］.J Phys Chem，1962，66： 455-463.

［8］馬貴斌，楊頻.熒光法研究血清自蛋白與藥物的結合作用［J］.生物化學雜志，1992，8(5)： 624-628.

［9］楊曼曼，楊頻，張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與自蛋白的作用［J］.科學通報，1994，39(1)： 31-38.

［10］Forster T. Modern Quantum Chemistry (Vol.3) ［M］. New York：Academic Press, 1996： 93-106.

［11］Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy ［M］.3rd Ed. New York： Springer, 2006： 445-457.

［12］Ross P D, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions： forces contributing to stability ［J］. Biochemical, 1981, 20(11)： 96-102.

［13］熊和玉，汪敬武.頭孢菌素類抗生素分析方法研究進展［J］.江西化工，2003(3)： 16-22.

［14］劉洛生，趙麗，葛蔚穎.頭孢克羅與人血清白蛋白相互作用機制［J］.光譜學與光譜分析，2003，23(4)： 769-774.

SPECTROSCOPIC STUDIES OF INTERACTION BETWEEN CEPHRADINE AND BOVINE SERUM ALBUMIN

Song Xixi, Chen Shuda, Liu Tao
(College of Biological, Chemical Sciences and Engineering, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China)

The interaction between cephradine and bovine serum albumin (BSA)was investigated by fluorescence and UV absorption spectroscopy. In the mechanism discussion，it was proved that the fluorescence quenching of BSA by cephradine resulted from the formation of cephradine-BSA complex. The quenching constantkqand the binding constantKat different temperatures were calculated. The thermodynamic parameters，enthalpy change(ΔH), entropy change(ΔS) and Gibbs free energy change (ΔG) were calculated respectively，which indicated that the interaction of cephradine with BSA was a spontaneous process mainly by hydrophobic interaction.

cephradine, bovine serum albumin, fluorescence quenching, thermodynamic parameter

2011-05-08