HPLC法同時測定四逆湯中3種有效成分的含量

高志祥，姜笑寒，王巖，王琳，姜志明，孟繁浩

（1.中國醫科大學藥學院藥物化學教研室，沈陽 110001；2.廣東省食品藥品職業技術學校，廣州 510663；3.沈陽軍區總醫院醫學實驗科，沈陽 110015）

四逆湯為張仲景所創名方，始載于《傷寒論》，為歷版中國藥典所收載的成方。本方由附子、干姜、甘草組成，配伍極為精簡嚴謹。其功效為回陽救逆，主治少陽病。癥見陽虛欲絕、冷汗自出、四肢厥逆、惡寒倦臥、嘔吐不渴、腹痛下利、神衰欲寐、舌苔白滑、脈象微細等癥。在現代臨床中應用廣泛，并均收到良好的療效。其方劑也成為現代中藥研究的首選之一［1］。現代醫學認為四逆湯有強心、抗休克、保護受損傷心血管系統、抗血脂及對病理狀態下的機體有免疫調節等多種藥理作用［2］，同時還具有保護腸黏膜及腦缺血等療效［3］。研究表明烏頭類生物堿既是其強心作用的有效成分又是其毒性成分［4］。為了更好的控制該藥品的內在質量，保證臨床用藥的安全有效，本研究選用烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿作為四逆湯質量控制的指標，采用高效液相色譜法對其成分進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑：Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Agilent 1200系列雙元泵，Agilent 1200可變波長檢測器，Agilent 1200化學工作站；SB25-120超聲清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；烏頭堿對照品（批號：110720-200410）、新烏頭堿對照品（批號：799-9403）和次烏頭堿對照品（批號：798-9403）均有中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，三乙胺為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），流速為 1.0 mL·min-1，檢測波長為240 nm，柱溫為30℃。

1.2.2 對照品溶液的制備：采用十萬分之一天平精密稱取烏頭堿對照品3.01 mg、新烏頭堿對照品1.03 mg、次烏頭堿對照品2.02 mg，置于一10 mL瓶中，加入甲醇使溶解并稀釋刻度，混勻，得到混合對照品貯備液。

1.2.3 供試品溶液的制備：參照中國藥典（2005年第一部）第422頁方法制成四逆湯，減壓濃縮成稠膏狀。加入甲醇使溶解并超聲提取10 min，放至室溫，加入甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得。

1.2.4 陰性樣品的制備：按1.2.3項下的方法不加附子制備而成。

1.2.5 系統適用性實驗：在“1.2.1”的色譜條件下進樣，以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿色譜峰計算，理論板數均在5 000以上時，色譜峰對稱因子0.95~1.05，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿色譜峰與其他成分分離度大于1.5。

1.2.6 線性關系的考察：精密量取混合對照品貯備液適量，采用逐級稀釋法配制成分別含烏頭堿301、150.5、60.2、30.1、6.02 μg/mL，新烏頭堿 103、51.5、20.6、10.3、2.06 μg/mL，次烏頭堿 202、101、40.4、20.2、4.04μg/mL的系列混合對照品溶液。照“1.2.1”項下的色譜條件進樣20μL，測定峰面積。以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）做線性回歸。

1.2.7 精密度試驗：取同一混合對照品溶液，連續進樣5次，測定峰面積。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰RSD分別為0.79%、0.37%、0.90%。

1.2.8 穩定性試驗：取批號為201001的供試品溶液分別于 0、4、8、16、24 h 進樣 20 μL，測定峰面積。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿峰RSD分別為0.29%、0.32%、0.64%。

1.2.9 重復性試驗：取批號為201001供試品，精密稱定5份，測定含量。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量的RSD分別為1.05%、0.94%和0.98%。

1.2.10 回收率試驗：取批號為201001的樣品，精密稱定6份，分別置10 mL量瓶中，精密加入19μg/mL烏頭堿對照品溶液1 mL，10μg/mL新烏頭堿對照品溶液1 mL，400μg/mL次烏頭堿對照品溶液1 mL，定容至10 mL。依法測定，計算回收率。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均回收率分別為100.74%（RSD=1.88%）、99.9%（RSD=2.98%） 和 102.9%（RSD=1.32%）。

2 結果

2.1 對照品、供試品及陰性樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液（A）、供試品溶液（B）陰性樣品（C）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards（A），sample（B）and feminine sample（C）

2.2 樣品的測定

按照中國藥典2005年版一部422頁方法制備四逆湯樣品5批，按“1.2.3”項制備供試品溶液，照“1.2.1”項下的色譜條件測定，采用外標法計算含量，見表1。

3 討論

3.1 流動相的選擇

流動相選用甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），葛爾寧等［5］也進行過相關研究，以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）為流動相，其流動相較復雜。本方法創新之處在流動相中去掉了塑形劑氯仿，分離效果良好，而且流動相更為溫和，有利于色譜柱的長期使用，方法簡便可行。同時通過考察不同比例的甲醇-0.1%三乙胺（50∶50；55∶45；60∶40；65∶35）對分離效果的影響，結果表明甲醇-0.1%三乙胺（65∶35）對3種生物堿的分離最好。

3.2 提取時間的選擇

生附子中的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿均為劇毒生物堿，有報道稱3 mg的烏頭堿即可以使人死亡［6］，因此提取時間的選擇就顯得尤為重要，提取時間過短則劇毒性烏頭堿含量過大，過長則有效成分的活性會大大降低。葛爾寧等在研究過程中發現四逆湯中附子、干姜和甘草在滾煎時70 min中后烏頭堿的含量減半。線性范圍大大增大、更有利于對四逆湯進行質量控制。

表1 四逆湯樣品含量測定結果（n=5）Tab.1 The quantitative results of Sinitang（n=5）

［1］王曉琳.中藥方劑“四逆湯”分析［J］.中醫中藥導報，2010，7（6）：104.

［2］劉平，葛迎春，馬天舒.四逆湯類方藥理研究進展［J］.遼寧中醫雜志，2007，34（2）：248-251.

［3］商李超，郁寶生.四逆湯的藥理作用研究進展［J］.中西醫結合心血管病雜志，2009，7（11）：1333-1335.

［4］肖鳳霞，周莉玲，李銳.四逆湯制劑中烏頭生物堿的藥動學相關性研究［J］.中藥材，2005，28（7）：587-588.

［5］葛爾寧.通脈四逆湯毒性分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12（5）：12-14.

［6］中國醫學科學院藥物研究所.中藥志［M］.2版.北京：人民衛生出版社，1982：138.