外源性硫化氫對嗜鉻細胞瘤細胞β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1表達的影響

代政偉，張華，孟濤，晏寧，李潔穎，晏勇

（重慶醫科大學1.附屬第一醫院神經內科，重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016；2.附屬第二醫院神經內科，重慶400010）

β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1） 是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）產生 β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的限速酶［1］，其活性或表達增加是阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）發病的中心環節，因此對BACE1的調節干預成為AD治療研究領域的熱點問題。近來發現，生理濃度下的硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）能夠激活包括磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3 kinase/serine threonine kinase，PI3-K/Akt）及絲裂酶原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶 1/2（mitogen-activated protein kinase/extracellular singal-regulated kinase 1/2，MAPK/ERK1/2） 在內的多種信號通路，發揮廣泛的調節功能［2］，而AD患者腦及血漿中內源性H2S含量明顯降低［3］，且降低的水平與患者病情嚴重程度呈正相關［4］，表明H2S減少與AD發病有著密切的關聯。但是，H2S與BACE1的關系目前尚未見報道。因此，本文旨在探討外源性H2S對BACE1表達的影響及可能涉及的細胞信號機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞株由重慶醫科大學重慶市神經病學重點實驗室提供；RPMI 1640培養基、胎牛血清、NGF（GIBCO公司）；NaHS（Sigma公司）；RT-PCR試劑盒［寶生物（大連）有限公司］；BACE1抗體（Merck公司）；小鼠抗Akt1、兔抗大鼠Ser473位點磷酸化Akt1/2/3（pAkt1/2/3）、ERK1/2、Thr202 位點磷酸化 ERK1/2（pERK1/2）抗體（Santa Cruz公司）；PI3-K 抑制劑 LY294002、MEK抑制劑PD98059（Cayman Chemical公司）；大鼠Aβ42酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢優爾生科技有限公司）。

1.2 細胞培養及處理

PC12細胞株接種于6孔細胞培養板，RPMI 1640完全培養基（含10%的胎牛血清，100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）在37℃、5%CO2的培養箱中培養，傳代24 h后換液，加入終濃度為50 ng/mL的NGF，誘導其向神經元樣PC12細胞分化，3周左右至完全，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞隨機分為空白對照組、NaHS 組 （NaHS 50、100、200 μmol/L組）、LY294002預處理組（LY 25μmol/L+NaHS 200 μmol/L、LY 50 μmol/L+NaHS 200 μmol/L組）和PD98059預處理組（PD 25μmol/L+NaHS 200 μmol/L、PD 50μmol/L+NaHS200μmol/L組）。處理時吸棄舊培養基，洗滌后加入不含胎牛血清的新鮮培養基，并分別加入終濃度為分組劑量濃度的NaHS或通路抑制劑，預處理組抑制劑先于NaHS30 min加入。處理完成的各組細胞在相同培養箱中繼續孵育24 h后，分別收獲細胞及培養液用于指標檢測，完全重復實驗3次。

1.3 RT-PCR檢測BACE1 mRNA的表達

按試劑說明書操作步驟抽提RNA，逆轉錄cDNA。Primer Premier 5.0軟件設計 BACE1及 β-actin引物，由上海生工科技公司合成。BACE1上游引物：5′TTTCCCAGTCATTTCACTTTAC 3′， 下 游 引 物 ：5′GCCGTCCTGAACTCATCG 3′。β-actin 上游引物：5′CCACTGCCGCATCCTCTT 3′，下游引物：5′GGACTCATCGTACTCCTGCT 3′。BACE1 PCR反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35個循環；72℃，10 min。BACE1與β-actin終產物片段長度分別為267 bp和413 bp，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統掃描圖像，光密度分析，計算BACE1/β-actin光密度比值為目的基因的相對表達水平。

1.4 Western blot檢測 BACE1、pAkt、pERK1/2 蛋白的表達

PBS洗滌細胞2次，加入全蛋白提取液及PMSF緩沖液，冰浴裂解細胞，提取蛋白，BCA法定量。取樣品25μg行SDS-PAGE電泳，將凝膠中蛋白濕法電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST液封閉。分別加入兔多抗 BACE1（1∶250）、pAkt1/2/3（1∶500）、ERK1/2（1∶250）、pERK1/2（1∶300）抗體和小鼠抗 Akt1（1∶250）、β-actin 單抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，洗滌后孵育二抗（羊抗兔和羊抗小鼠抗體1∶2 000）。ECL試劑發光顯影成像，X線片拍照保存。光片置于凝膠成像系統白光下掃描，蛋白的相對表達 水 平 分 別 用 BACE1/β-actin、pAkt1/Akt1 和（pERK1/2）/（ERK1/2）的光密度比值來表示。

1.5 ELISA法檢測細胞培養液中Aβ42水平的變化

離心并取細胞培養液上清。室溫下配制標準品、檢測溶液、洗滌液、TMB底物溶液以及反應終止液。設標準孔、待測樣品孔和空白孔，按試劑盒說明書操作步驟加液、甩干、洗滌及孵育。TMB底物溶液，37℃避光顯色。適時終止反應。酶標儀450 nm波長測量光密度值，以標準品濃度與光密度對數值為坐標繪制標準曲線，計算蛋白表達水平。

1.6 統計學分析

采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理。計量數據以x±s表示，各組均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的外源性H2S對BACE1表達的影響（圖 1）

圖1 不同濃度NaHS對BACE1 mRNA及蛋白表達的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaHS on the expressions of BACE1 mRNA and protein

RT-PCR結果顯示，對照組內有自發的BACE1 mRNA表達（1.059±0.114），各NaHS組其表達隨NaHS濃度增加而減少［分別為（0.850±0.096）、（0.517±0.060）和（0.303±0.065）］，組間比較差異有統計學意義（F=45.523，P=0.000），且各 NaHS 組分別與對照組比較差異也有統計學意義（分別為t=2.947，P=0.019；t=7.669，P=0.000；t=10.689，P=0.000）；Western blot結果與PCR相似，自對照組至各NaHS組蛋白表達依次下調［分別為（0.999±0.041）、（0.638±0.085）、（0.404±0.071）、（0.251±0.054）］，差異有統計學意義（F=75.446，P=0.000），各 NaHS 組與對照組比較差異有統計學意義（分別t=6.820、11.235、14.109，均 P=0.000）。

2.2 LY294002對外源性H2S誘導的PI3-K/Akt通路下游蛋白Akt1磷酸化的影響及BACE1表達變化的調節（圖2）

圖2 pAkt1蛋白在各細胞組中的表達及LY294002對NaHS誘導的BACE1表達變化的影響Fig.2 Expression of pAkt1 protein in different groups and the effect of LY294002 on the change in BACE1 expression induced by NaHS

Western blot結果顯示，NaHS 200μmol/L組pAkt1蛋白表達上調（1.398±0.100），較對照組（0.780±0.053）有統計學差異（t=11.267，P=0.000）；與NaHS 200μmol/L組相比，LY294002預處理組NaHS誘導的Akt1磷酸化被不同程度抑制，pAkt1表達隨抑制劑濃度增加而降低［分別為（0.986±0.565）和（0.571±0.045）］，差異有統計學意義（F=100.845，P=0.000；t=7.074，P=0.000；t=14.202，P=0.000）；而 200 μmol/L NaHS下調BACE1的作用被削弱，BACE1蛋白表達［分別為（0.759±0.070）和（0.976±0.113）］較 NaHS 200μmol/L 組（0.257±0.064）上調，差異有統計學意義（F=56.277，P=0.000；t=7.214，P=0.000；t=10.344，P=0.000）。

2.3 PD98059對外源性H2S誘導的MAPK/ERK1/2通路下游蛋白ERK1/2磷酸化的影響及BACE1表達變化的調節（圖3）

圖3 Western blot法檢測pERK1/2蛋白在各細胞組中的表達及PD98059對NaHS誘導的BACE1表達變化的影響Fig.3 Expression of pERK1/2 protein in different groups and the effect of PD98059 on the change in BACE1 expression induced by NaHS

Western blot結果顯示，NaHS 200μmol/L組pERK1/2蛋白表達水平較對照組上調［分別為（1.554±0.107）和（0.917±0.092）］，差異有統計學意義（t=9.053，P=0.000）；PD98059 預處理組中 NaHS 誘導的pERK1/2表達上調被抑制，且pERK1/2表達隨PD98059濃度增加而下降［分別為（0.990±0.088）和（0.693±0.045）］，與 NaHS 200μmol/L 組比較差異有統計學意義（F=80.970，P=0.000；t=8.204，P=0.000；t=12.527，P=0.000）；但 PD98059 預處理未能削弱NaHS下調BACE1的作用，預處理組［分別為（0.259±0.086）和（0.280±0.106）］與 NaHS200 μmol/L組（0.266±0.064）比較，BACE1水平無明顯改變，差異無統計學意義（F=0.047，P=0.954；t=0.190，P=0.855；t=0.114，P=0.913）。

2.4 外源性 H2S對 Aβ42蛋白表達的調節及LY294002和PD98059對其影響（圖4）

圖4 各細胞組Aβ42蛋白表達的ELISA結果Fig.4 Expression of Aβ42 protein in different groups detected by ELISA

ELISA結果顯示，與對照組（36.812±2.480）相比，各NaHS處理組培養液中Aβ42表達水平隨NaHS濃度增加依次下調［分別為（28.409±1.337）、（21.537±2.964）和（13.313±3.664）］，在 LY294002 預處理組，Aβ42表達又增加至 23.040±4.001和 35.682±1.205，在 PD98059預處理組，Aβ42表達仍在較低的水平［分別為（13.394±3.051）和（14.214±4.633）］，其中各NaHS處理組與對照組比較均有統計學差異（F=39.768，P=0.000；t=3.749，P=0.006；t=6.815，P=0.000；t=10.483，P=0.000），LY294002 預處理組與NaHS 200μmol/L組比較，差異有統計學意義 （F=36.572，P=0.000；t=3.709，P=0.010；t=8.528，P=0.000），而PD98059預處理組與NaHS200 μmol/L組比較，差異無統計學意義（F=0.051，P=0.951；t=0.026，P=0.980；t=0.288，P=0.783）。

3 討論

Aβ沉積形成老年斑是AD最主要的病理改變，其產生的神經毒性作用可導致AD發病。研究發現，淀粉樣蛋白斑塊周圍的神經元內BACE1水平增高［5］，而BACE1基因缺失可以減少Aβ的產生及沉積，挽救認知和海馬膽堿能神經功能障礙［6］，所以大部分學者認為BACE1在Aβ生成中扮演著關鍵性角色，是AD病理過程的重要因素。作為繼NO、CO之后第3種氣體信號分子，H2S對神經系統的調節十分重要，其濃度過高可導致機體中毒，過低也可能引起疾病的發生與進展。H2S參與AD發病的可能機制目前認為主要與血清H2S水平降低影響海馬長時程形成及突觸活動而損害學習和記憶，H2S減少影響其抗氧化的神經保護作用以及H2S減少引起的腦血管張力增加致使腦組織長期慢性缺血等原因有關［6］。但H2S水平的改變能否影響BACE1表達進而參與AD病理過程尚不清楚，所以我們對此進行了研究。

據報道，NaHS在溶液中解離可提供原始濃度33%左右的H2S，較直接泵入H2S氣體更穩定，因此我們采用NaHS作為外源性H2S的供體取代直接泵入H2S。選取PC12細胞作為研究對象，是因其被NGF誘導分化后具有神經細胞特性，又可穩定傳代，是國際上公認的體外研究神經生物、化學及神經疾病的理想模型。本實驗結果顯示，50～200μmol/L NaHS處理PC12細胞，從基因與蛋白水平上呈劑量依賴性下調BACE1的表達。因此我們認為，實驗濃度范圍內的NaHS釋放的H2S因遠遠低于哺乳動物腦內H2S的生理濃度（50～160μmol/L）上限，對PC12細胞沒有毒性，卻有抑制BACE1表達的作用。腦和血漿中內源性H2S降低的AD患者病理效應的產生可能與BACE1表達增加有關。

PI3-K/Akt與MAPK/ERK1/2通路是細胞內重要的信號轉導通路，其下游關鍵蛋白Akt及ERK1/2磷酸化增加時，通路被激活。動物實驗已經證實pAkt水平降低與AD有必然的聯系［7］，而MAPK/ERK1/2通路的激活也從多方面參與了學習、記憶的形成過程［8］。因此，為了進一步探討H2S調節BACE1的細胞信號機制，我們分別用不同濃度的特異性抑制劑預先阻斷上述2條通路，然后與200μmol/L NaHS共同培養細胞。結果發現，單純的NaHS處理使pAkt1、pERK1/2表達上調，同時BACE1表達下降，阻斷PI3-K/Akt通路使NaHS的這種作用被削弱，而阻斷MAPK/ERK1/2通路其表達無明顯變化。因此，我們推測外源性H2S調節PC12細胞BACE1的表達可能是通過PI3-K/Akt通路及其下游信號蛋白的激活實現的，與MAPK/ERK1/2通路激活無關。我們的前期研究結果顯示，PI3-K/Akt信號通路受損明顯上調BACE1表達［9］，也支持我們的推測。有學者在采用NT2細胞研究MAPK/ERK1/2通路對BACE1的影響時發現，通路有負性調節BACE1活性與表達的作用［10］，與我們的實驗結果不一致，這是否與不同細胞系內活化的pERK1/2出現轉運或其在細胞亞結構的定位聚集不同而失作用于下游目的蛋白有關，仍需結合其它可能因素做進一步分析。

Aβ是APP經BACE1裂解途徑代謝的終產物，腦內有病理意義的 Aβ 包括 Aβ40和 Aβ42，Aβ40水平遠遠高于Aβ42，但后者更易沉積，是形成老年斑的主要成分，故我們對Aβ42進行了檢測。發現NaHS同樣下調了Aβ42表達，并且這種作用被阻斷PI3-K/Akt通路所拮抗，而與阻斷MAPK/ERK1/2通路無關。一般認為，Aβ的神經毒性主要是通過氧化應激引起的，但氧化應激本身又會促進Aβ的產生、聚集和沉積，有研究指出，H2S能對抗谷氨酸［11］和HOCL［12］引起的氧化應激，所以基于上述理論我們有理由認為，外源性H2S可能正是通過其抗Aβ產生的氧化應激作用負性調節BACE1表達進而反饋下調Aβ的，但目前尚難定論。然而本實驗應用外源性H2S從病理起源上減少了Aβ的產生，為AD的臨床治療提供了合理的設想。

總之，我們的研究表明，外源性H2S具有下調PC12細胞BACE1表達的作用，其信號機制可能涉及PI3-K/Akt通路的激活，與MAPK/ERK1/2通路激活無關。用外源性H2S調節BACE1，為臨床上防治AD開辟了新的思路，也為進一步研發具有釋放H2S功效的藥物提供了新的理論依據。

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