碳酸酐酶Ⅰ、Ⅱ在結直腸癌中的表達及意義

王寧，陳洋，姜奕

（中國醫科大學附屬第一醫院1.普通外科；2.中心實驗室，沈陽 110001）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道腫瘤，目前認為其發生、發展經歷從正常上皮—增生—腺瘤—癌—浸潤轉移這樣一個過程［1，2］。碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CA）是一組催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反應的同工酶。CA家族包括十幾個成員，其中 CAⅠ、CAⅡ位于細胞質內［3，4］。迄今為止關于CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達情況的報道不多，它們的表達與CRC的發生、發展以及臨床病理特征的關系尚有待進一步闡明。本研究采用免疫組織化學法，對CAⅠ、CAⅡ在正常結直腸黏膜、息肉、腺癌及轉移淋巴結中的表達進行研究，探討CAⅠ、CAⅡ的表達與結直腸癌的發生、發展以及臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

取自中國醫科大學附屬第一醫院普通外科2008年3月至2010年9月術前未經放化療、手術切除的64例原發性CRC患者標本，患者平均年齡（61.4±12.5）歲，其中男33例，女31例。術后病理證實64例均為腺癌。術后病理證實的20個轉移淋巴結（lymph node metastasis，LNM）來自 15例腺癌，27個息肉（包括增生性息肉17個和腺瘤性息肉10個）來自上述15例腺癌同時切除的標本。另外3個腺瘤為結腸鏡無法電切，經手術切除并經術后病理證實。55個配對的正常黏膜取自CRC患者，距腫瘤10 cm以上肉眼觀察正常處。CRC中高分化18例，中分化33例，低分化13例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期31例，Ⅲ期25例，Ⅳ期4例。

CAⅠ羊抗人多克隆抗體、CAⅡ鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz公司（PBS稀釋，濃度為1∶100）。三步法免疫組織化學試劑盒購自福州邁新公司。

1.2 方法

對以上組織進行甲醛固定，石蠟包埋，連續切片。其中1張切片行HE染色供病理診斷，其余切片供免疫組織化學研究。

石蠟切片以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。新鮮配制的3%雙氧水，室溫15 min去除內源性過氧化酶。用蒸餾水和pH 7.4的PBS緩沖液清洗后，高溫高壓修復：置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液入高壓鍋中加熱至沸騰2 min，PBS緩沖液沖洗。滴加動物非免疫血清，室溫封閉1 h，滴加一抗，4℃孵育過夜。用PBS沖洗后，滴加生物素標記的二抗，室溫下反應20 min。再用PBS沖洗。滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫下反應20 min，PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染或輕染。自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，依信號的強弱分為陰性（-）0分，弱陽性（+）1分，中度陽性（++）2分，強陽性（+++）3分。

1.3 統計學處理

利用SPSS統計軟件，計量資料以x±s表示，采用秩和檢驗進行統計學分析，對有配對標本者進行配對秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CAⅠ、CAⅡ于胞質內著色，正常黏膜主要著色區位于腸腔側的腺細胞，而癌組織則無此特點。CAⅠ、CAⅡ信號在正常黏膜中最強，在增生和腺瘤性息肉減弱，CRC 中最弱（圖 1，2）。

圖1 CAⅠ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及轉移的淋巴結中表達 ×200Fig.1 The expression of CAⅠ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM（Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

圖2 CAⅡ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及轉移的淋巴結中表達 ×200Fig.2 The expression of CAⅡ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM （Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

CAⅠ強度在配對的正常黏膜、癌組織中分別為（2.95±0.23）和（1.64±0.52），二者差異有統計學意義（P＜0.01）。CAⅠ在增生性息肉和腺瘤性息肉中分別為（2.39±0.50）和（2.44±0.53），與配對的正常黏膜比較顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。CAⅠ在CRC中強度與匹配的息肉（2.41±0.50）比較顯著降低（P＜0.01）。然而，CAⅠ在配對的CRC和LNM 中表達強度相近，分別為（1.86±0.36）和（1.67±0.58），差異無統計學意義（P=0.10）。高、中、低分化的 CRC 中 CAⅠ表達分別為（1.84±0.50）和（1.63±0.50）、（1.57±0.51），雖逐漸降低但差異無統計學意義（P=0.21）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表達分別為（1.63±0.56）、（1.76±0.44），二者差異無統計學意義（P=0.33）。

CAⅡ表達在配對的正常黏膜、癌組織中分別為（2.80±0.49）和（1.20±0.87），二者差異有統計學意義（P＜0.01）。CAⅡ表達在增生性息肉和腺瘤性息肉中分別為（2.59±0.51）、（2.50±0.53），與配對的正常黏膜比較顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而增生性息肉與腺瘤性息肉間CAⅡ表達差異無統計學意義（P=0.66）。CAⅡ在CRC中表達與匹配的息肉（2.56±0.51）比較顯著降低（P＜0.01）。然而，CAⅡ表達在配對的CRC和LNM（1.35±0.67）中強度相近，差異無統計學意義（P=0.61）。高、中、低分化的CRC 中 CAⅠ表達分別為（1.34±0.91）、（1.17±0.90）、（0.96±0.63），雖逐漸降低但差異無統計學意義（P=0.60）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表達分別為（1.32±0.80）、（0.98±0.87），差異無統計學意義（P=0.91）。

3 討論

CA是一組含鋅的金屬酶，負責催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反應，以實現對酸堿平衡等的調節。據報道CAⅡ是CA家族中活性最高的，而CAⅠ的活性則為中等［3~5］。

由于CO2很容易被動彌散通過細胞膜，因此細胞質內的CAⅠ、CAⅡ在正常情況下主要是使反應向右進行，從而幫助CO2的跨膜轉運［4，6］。雖然腫瘤細胞外呈酸性（pH 5.6~6.8），但細胞內卻呈中性或堿性（pH 7.2~7.5）［3，7，8］。而 HCO3-是體內維持堿性環境的重要物質。因此，我們推測腫瘤細胞為了減少HCO3-的丟失，CAⅠ、CAⅡ表達降低。而來自糖酵解產生的乳酸等的H+則通過Na+/H+交換等主動排出細胞外［4，9］。

Kummola等認為，CAⅠ、CAⅡ基因均位于8號染色體q臂上，而且密切關聯。調控區域或等位基因的缺失或點突變可導致CAⅠ、CAⅡ的表達同時降低。并推測CAⅠ、CAⅡ可能發揮著抑癌功能［5］。

CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中的表達主要在臨近腸腔側，而且無論在正常結直腸黏膜組織中還是CRC中CAⅠ、CAⅡ表達高低與在結直腸中不同部位無關，與文獻報道相符［10］。CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中表達最強，在良性息肉、癌組織中逐級降低［10］。由于本組CRC中Ⅰ期和Ⅳ期僅各有4例，故我們將Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期分2組比較，并證實CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達與分期無關。Kivela等也認為CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達與Dukes分期無關［10］。但Bekku等用Western blot法研究證實CAⅠ、CAⅡ在CRC中的表達隨Dukes分期的進展顯著降低［11］。與Kivela等的結果不同［10］，本研究顯示雖然隨著分化程度的降低，CAⅠ、CAⅡ強度減弱，但差異無統計學意義。Bekku等［11］的研究表明CAⅠ的表達與CRC分化無關；但CAⅡ在結腸癌中，中分化低于高分化（P＜0.04），在直腸癌中的表達與分化無關。而Nieme等對77個遺傳性非息肉病性CRC的研究表明CAⅡ的表達與分化程度和Dukes分期均無關［12］。

近年關于CRC的比較蛋白質組學研究也顯示，CAⅠ、CAⅡ是CRC組織中表達顯著下調中的兩個蛋白［13~16］。而且將CAⅡcDNA克隆轉染CRC細胞后，癌細胞侵襲、趨化運動能力及耐藥性均明顯降低［13，14］。

本研究與Kivela等的結果相符，在淋巴結轉移中CAⅠ、CAⅡ的表達不再繼續降低，甚至略高于原發灶［10］。白雪等的研究也表明，與原發灶比較，肝轉移灶中CAⅡ的表達并未顯著降低［14］。

綜上所述，CAⅠ、CAⅡ是正常結直腸黏膜腺上皮細胞中所必需的酶。CAⅠ、CAⅡ的表達從增生性息肉和腺瘤開始即顯著低于正常黏膜，說明CAⅠ、CAⅡ表達下調是CRC發生中的早期事件。CAⅠ、CAⅡ在LNM中表達與原發灶相比無顯著差異，說明CAⅠ、CAⅡ表達下調與LNM無關。

［1］蒯筱漪，李正陽，張紅杰．線粒體解耦聯蛋白2在結腸癌中的表達及其臨床意義［J］．世界華人消化雜志，2010，18（21）：2202-2208．

［2］劉鐵權，孫明軍，魏敏杰．組蛋白去乙酰化酶1、2在大腸癌及腺瘤組織中的表達及其與臨床病理的關系［J］．世界華人消化雜志，2010，18（30）：3195-3199.

［3］Chiche J，Brahimi-Horn MC，Pouysségur J.Tumour hypoxiainducesa metabolic shift causing acidosis：a common feature in cancer ［J］.J Cell Mol Med，2010，14（4）：771-794.

［4］Potter CP，Harris AL.Diagnostic，prognostic and therapeutic implications of carbonic anhydrases in cancer［J］.Br JCancer，2003，89（1）：2-7.

［5］Kummola L，H覿m覿l覿inen JM，Karttunen T，et al.Expression of anovel carbonic anhydrase，CA ⅩⅢ，in normal and neoplastic colorectal mucosa［J］.BMCCancer，2005，5：41.

［6］Henry RP，Swenson ER.The distribution and physiological significance of carbonic anhydrase in vertebrate gas exchange organs［J］.Respir Physiol，2000，121（1）：1-12.

［7］Fang JS，Gillies RD，Gatenby RA.Adaptation tohypoxiaand acidosis in carcinogenesis and tumor progression ［J］.Semin Cancer Biol，2008，18（5）：330-337.

［8］Lindner D，Raghavan D.Intra-tumoural extra-cellular pH：a useful parameter of responsetochemotherapy in syngeneic tumour lines［J］.Br JCancer，2009，100（8）：1287-1291.

［9］Beltrán AR，Ramírez MA，Carraro-Lacroix LR，et al.NHE1，NHE2，and NHE4 contribute to regulation of cell pH in T84 colon cancer cells［J］.Pflugers Arch，2008，455（5）：799-810.

［10］Kivela AJ，Saarnio J，Karttunen TJ，et al.Differential expression of cytoplasmic carbonic anhydrases，CA Ⅰ and Ⅱ，and membrane-associated isozymes，CA Ⅸ and Ⅻ，in normal mucosa of large intestineand in colorectal tumors［J］.Dig Dis Sci，2001，46（10）：2179-2186.

［11］Bekku S，Mochizuki H，Yamamoto T，et al.Expression of carbonic anhydrase I or II and correlation to clinical aspects of colorectal cancer［J］.Hepatogastroenterology，2000，47（34）：998-1001.

［12］Niemel覿AM，Hynninen P，Mecklin JP，et al.Carbonic anhydrase Ⅸishighly expressed in hereditary nonpolyposiscolorectal cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（9）：1760-1766.

［13］白雪，李世擁，于波，等.結直腸癌原發灶和正常腸黏膜組織相關差異表達蛋白研究［J］.解放軍醫學雜志，2008，33（5）：495-497.

［14］白雪，李世擁，安萍，等.結直腸癌原發灶和肝轉移灶組織中蛋白質組差異表達及臨床意義［J］.中華醫學雜志，2005，85（30）：2128-2131.

［15］Bi X，Lin Q，Foo TW，et al.Proteomic analysis of colorectal cancer reveals alterations in metabolic pathways：mechanism of tumorigenesis［J］.Mol Cell Proteomics，2006，5（6）：1119-1130.

［16］Kim H，Kang HJ，You KT，et al.Suppression of human seleniumbinding protein 1 isa late event in colorectal carcinogenesisand is associated with poor survival［J］.Proteomics，2006，6（11）：3466-3476.