不同固定液對大鼠脾石蠟切片HE染色標本的影響

孫海梅 尚宏偉 張立新 季鳳清 周德山*

①首都醫科大學組胚教研室 北京 100069

脾臟是哺乳動物體內最大的淋巴器官，富含血管和血竇等。雖為實質性器官，但制作脾石蠟切片難度較大，每一個操作步驟均可影響最終的標本質量。其中固定液的選擇尤為重要，直接影響最終的標本染色效果[1-2]。

1 材料與方法

1.1 儀器設備和主要試劑[3]

LEICA ASP 300自動脫水機。LEICA EG 1160自動包埋。LEICA RM 2235輪轉式石蠟切片機。LEICA AUTO STAINER XL自動染色機。LEICA Q550IW圖像分析系統。主要試劑有中性福爾馬林固定液；Bouin固定液；Helly固定液；Ehrlich蘇木精；1%伊紅水溶液。

1.2 實驗動物

選用健康成年SD大鼠1只，雌雄不拘。

2 實驗方法

2.1 取材和固定

大鼠經乙醚麻醉，剪斷頸總動脈放血處死，以減少脾內多余的血液成分。為保持脾結構的完整性，取材時應格外小心，盡量減少金屬器械觸碰脾實質，用鑷子夾持脾周圍的結締組織，小心剝離剔除脾周圍多余組織，切取一塊近似等邊三角形組織塊，厚度為5～7 mm，迅速投入固定液中。選擇合適的固定液是制作良好脾標本的關鍵。對此嘗試以下常規固定液[3]：中性福爾馬林固定液，固定時間為24 h。Bouin固定液，固定時間為24 h。Helly固定液，固定12 h。

2.2 固定后處理

根據不同固定液的要求，采取不同的固定后處理。中性福爾馬林固定后流水沖洗12 h，蒸餾水洗。Bouin固定的組織直接使用70%乙醇，去除固定液中苦味酸的黃色。Helly固定的組織流水沖洗12 h，除去固定液中重鉻酸鉀后蒸餾水洗。

2.3 脫水和透明

用LEICA ASP 300自動脫水機將所有的固定后的組織常規脫水、透明。注意嚴格控制無水乙醇、二甲苯和浸蠟時間，防止組織變硬變脆影響切片效果。具體步驟：用70%乙醇、80%乙醇、 90%乙醇、95%乙醇脫水各3 h，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水各2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各20 min，石蠟Ⅰ，石蠟Ⅱ浸蠟各40 min。

2.4 包埋和切片

用LEICA EG 1160自動包埋機進行石蠟包埋。脾臟是細胞密集的結構，切片過厚將影響觀察效果。用LEICA RM 2235輪轉式石蠟切片機切片，厚度為4μm，切片用烤箱50oC烘干。

2.5 HE染色和封片

用LEICA AUTO STAINER XL自動染色機進行HE染色。不同的固定液處理的組織切片在HE染色中，蘇木精和伊紅的染色及分色時間有所不同，染色中通過隨時鏡檢，優化每一種固定液處理的組織切片的最佳的染色時間，獲得每種固定液處理的組織切片最佳染色標本。具體步驟如下。

⑴中性福爾馬林固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s。

⑵Bouin固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色20 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色13 min；90%乙醇分色40 s。

⑶Helly固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s。

封片使用中性樹膠封固。

3 結果

用LEICA Q550IW圖像分析系統對3種不同的固定液處理的大鼠脾組織石蠟切片染色結果進行顯微鏡下觀察（染色結果見圖1、2、3），并從以下方面進行比較[4-5]，見表1。

圖1 大鼠脾石蠟切片HE染色標本中性福爾馬林固定×100

圖2 大鼠脾石蠟切片HE染色標本Bouin固定液固定×100

圖3 大鼠脾石蠟切片HE染色標本Helly固定液固定×100

表1 不同固定液對大鼠脾石蠟切片HE染色結果的比較

4 討論

組織固定的作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀,保持細胞、組織原有的形態[6]。固定是制作脾石蠟切片標本的關鍵環節，固定液中的化學成分的滲透力，PH值，滲透壓，固定時間等諸多因素影響固定液的固定效果[7]。所以選擇最佳的固定液將會直接影響標本的質量和染色結果。經三種不同的固定液處理的大鼠脾石蠟切片HE染色標本的染色效果各有不同，各有其優缺點：中性福爾馬林固定液：是實驗室常規試劑[8]，配制簡單易行。但由于固定液中化學成分的滲透壓等原因造成結構破損，使切片出現明顯的皸裂現象[9]；Bouin固定液：亦為實驗室常規固定液，配制簡單易行，此固定液是由甲醛、苦味酸和醋酸按一定比例混合而成, 苦味酸和醋酸配合使用能很好的保存組織結構，因此固定的標本組織結構完整。但染色不及其它兩種固定方法染色理想，細胞核與細胞質對比強度不明顯[10]；Helly固定液：此固定液主要成分是氯化汞和重鉻酸鉀，甲醛等，氯化汞使組織硬化快，對細胞核和胞質固定良好，并促進染色，重鉻酸鉀常用于混合固定液中，有助于組織染色[2]。所以經此固定液固定的組織結構完整，清晰，染色鮮艷，細胞核與細胞質染色對比度好，為制作脾石蠟切片標本理想的固定液。但此固定液配制較復雜,且固定后需去除組織內的重鉻酸鉀和“汞色素”，步驟較復雜。且此固定液中氯化汞屬于劇毒藥品，管理要嚴格，廢液需要妥善處理，避免環境污染。

5 結語

獲得理想的脾石蠟切片HE染色切片的方法：大鼠經乙醚麻醉、頸總動脈放血，標本經Helly固定液固定，常規脫水、透明、包埋，石蠟切片4μm，HE染色Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s，可獲得較理想的脾石蠟切片HE染色標本。

[1]趙年彪.組織切片技術淺見[J].中國獸醫雜志,2009,45(3):77-78.

[2]楊群,胥維勇,何娟,等.不同固定液冷凍切片HE染色質量的對比觀察[J].實用醫院臨床雜志,2010,7(3):69-70.

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[5]王正義,柏戒,王亞平.固定液對恒冷箱切片組織結構與染色效果的比較觀察[J].重慶醫科大學學報,1999,24(1):64-65.

[6]龔志錦,詹镕洲.病理組織制片和染色技術[M].上海:科學技術出版社,1994:32-36.

[7]趙熒,唐軍民,孫海梅,等.形態學實驗技術[M].北京:北京大學醫學出版社,2008.

[8]王阿力,王興海,石瑾,等.使用福爾馬林固定液的幾個問題及解決方法[J].解剖學雜志,1997,20(6):613.

[9]宋容.新配方淋巴結固定液在HE制片中的應用探討[J].檢驗醫學與臨床,2005,2(3):114.

[10]王伯云,李玉松,黃高昇,等.病理學技術[M].北京:人民衛生出版社,2000:25-31.