喉癌組織中內皮素1表達與淋巴管和血管生成的相關性研究

王 瑩，李文媛，楊春壯，馮克儉

（牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江牡丹江 157011）

內皮素（endothelin，ET）是一種具有多種生物學效應的活性肽。ET家族中與腫瘤關系最密切的是血管ET-1［1］，不僅產生于血管內皮細胞，也可由人體內多種腫瘤細胞所分泌，是近年來腫瘤防治研究的熱點。有研究表明，在口腔癌、卵巢癌、甲狀腺癌、皮膚癌、肺癌等［2-6］多種惡性腫瘤中可見ET-1有高表達，并與腫瘤的發生、發展有顯著關系，但ET-1在喉癌中的作用尚未見相關報道。為此，該研究對喉癌中ET-1表達與淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）、微血管密度（microvessel density，MVD）、淋巴結轉移和喉癌預后的關系進行研究，旨在為喉癌的診治研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 取中國醫科大學附屬第一醫院耳鼻喉科2004年1月至2009年3月首次手術治療的原發喉癌患者，共計45例。男43例，女2例，患者年齡41～86 歲，中位年齡63.5歲。聲門上癌17例，聲門癌23例，聲門下癌 5例。按1997年UICC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期31例。有頸部淋巴結轉移者15例，淋巴管浸潤者8例，所有病例均無遠處轉移，術前未接受化療、放療及其他抗癌治療。生存資料通過信訪或電話獲得，生存期開始時間自手術日期始，至2009年6月1日止，其中2例失訪。生存期計算以月為單位，未滿整月以實際生存天數計算。隨訪期限為3～71個月，中位數為31個月。死亡病例均由復發或轉移引起。同時收集10例正常喉良性病變用于對照。

1.2 主要試劑 二甲胂酸鈉，腺苷-5'-磷酸鈉，萘酚AS-MX磷酸鈉，左旋咪唑，固藍BB鹽，二甲基甲酰胺（DMF）均購自美國 SIGMA公司。兔抗人 ET-1抗體、兔抗人CD34抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中山生物試劑公司橋生物公司，抗β-actin抗體購于Santa Cruz公司。

1.3 免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟至水，0.5%過氧化氫孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀釋后的一抗ET-1（1∶100）、CD34（1∶100）。4℃過夜。滴加生物素標記體，30 min，37℃。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37℃，30 min。3，3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色液顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析:隨機選取5個高倍視野按陽性細胞比例及著色程度記分，行半定量分析。無著色細胞記為0分;著色細胞比例≤1/3記為1分;1/3＜著色細胞比例≤2/3記為2分;著色細胞比例＞2/3記為3分。淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分;然后根據二者乘積判斷陽性結果:二項乘積≤3分記為（－）;＞3分記為（+）。MVD定量分析:采用 Weidner等［7］制訂的方法確定微血管密度，先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區域，在高倍鏡下計數5個視野微血管數取其平均值作為微血管密度。

1.4 酶組化染色方法 冰凍切片吹干后，分兩組:A組作5'-Nase染色，即將切片置入5'-Nase標準液（反應液）內，37℃孵育40 min。水洗后入1%硫化銨內2 min后封片，光鏡下觀察結果。反應液內含有0.2 mol/L的 Tris-順丁稀二酸緩沖液（pH7.2）20 mL，腺苷5'-磷酸鈉（5'-AMP）25 mg，硫酸鎂123 mg，硝酸鉛60 mg，蔗糖3 g，蒸餾水22 mL。B組作對照試驗，將孵育液中的底物去除，即再反應液內不加腺苷5'-磷酸鈉，其余步驟同A組。LVD定量分析:參照Kaiserling［8］計數方法，先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區域，在高倍鏡下計數5個視野淋巴管數，取其均值作為該切片淋巴管數。

1.5 Western blot檢測 檢測ET-1提取蛋白后采用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白后轉至硝酸纖維素膜;封閉緩沖液封閉后，加入一抗（anti-ET-1，1∶100稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶2000稀釋）孵育2 h，TBS洗凈后經顯色液顯示15 min，掃描后經ImageJ圖像分析軟件對印跡區進行灰度分析。

1.6 統計學方法 所得數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計數資料采用 χ2檢驗，兩組間LVD、MVD比較采用t檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線差異性采用 Log-rank法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉癌組織中ET-1的表達與臨床病理參數的關系 ET-1陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，呈棕黃色顆粒（圖1A），陰性細胞胞質不著色。5'-Nase特異性地表達在喉癌組織中毛細淋巴管內皮細胞，標記毛細淋巴管呈棕色管腔（圖1B），血管內皮細胞和腫瘤細胞未見表達。CD34染色后微血管內皮細胞胞質呈棕黃色，標記微血管呈棕色管腔（圖1C）。ET-1在喉癌組織蛋白表達顯著高于正常組織（χ2=7.084，P＜0.05）。在各種臨床病理因素中，ET-1蛋白表達與淋巴管密度（t=38.633，P=0.042）、微血管密度（t=229.614，P=0.05）、TNM 病理分期（χ2=7.106，P=0.05）、淋巴結轉移（χ2=7.679，P=0.05）和淋巴管浸潤（χ2=7.784，P=0.05）密切相關，但與年齡、性別、腫瘤部位、組織學分級無關（χ2=3.375、2.616、2.492、2.510，P＞0.05）（表1，2）。

圖1 A 喉癌組織中ET-1陽性表達（SP×200） 圖1B 喉癌組織中淋巴管（5'-Nase×200） 圖1C 喉癌組織中微血管（SP×200）

2.2 Western-blot檢測喉癌組織中ET-1的表達Western-bolt檢測6例喉癌組織和6例喉良性病變組織中ET-1蛋白表達，結果顯示喉癌組織中ET-1蛋白的相對表達較正常喉組織顯著增高（t=28.838，P＜0.05）（圖 2）。

2.3 ET-1陽性表達與生存率的關系 按ET-1表達陰性和陽性將喉癌患者分為兩組［（－）為陰性，（+）為陽性］，Kaplan-Meier生存分析繪出喉癌患者整體生存曲線，ET-1陽性表達平均生存時間為37個月，陰性表達組平均生存時間為55個月，Log-rank檢驗表明兩組生存率無顯著性差異（χ2=1.148，P＞0.05）（圖3）。

圖2 ET-1蛋白在喉癌與配對良性病變組織中的表達

圖3 喉癌患者整體生存曲線

表1 喉癌組織中ET-1的表達與臨床病理因素的關系

表2 喉癌組織中ET-1的表達與LVD、MVD的關系±s）

表2 喉癌組織中ET-1的表達與LVD、MVD的關系±s）

注:*與ET-1陰性組比較，P＜0.05

組別 例數 ET-1（+）（n=25） （－）（n=20）LVD 45 12.82 ±5.79 5.77 ±2.83 MVD 45 24.82 ±8.54 18.91 ±7.42 t 38.633 29.614 P 0.042* 0.009*

3 討論

目前的研究發現，ET-1在多種人類惡性腫瘤發生、發展中發揮著重要作用，引起了國內外學者的重視，有研究表明其促腫瘤的作用機制可能包括以下幾個方面:①通過細胞內一系列信息轉導途徑引起細胞有絲分裂和增殖［9］。②促進新生腫瘤血管形成［10］。③抑制腫瘤細胞凋亡［11］。④促進腫瘤轉移與侵襲［12］。但ET-1是否在喉癌中發揮相同作用尚不清楚。本研究發現喉癌組織中ET-1蛋白表達顯著增高，與TNM臨床分期、淋巴結轉移等病理因素密切相關，說明ET-1能夠在喉癌的發生和發展中發揮重要作用。楊小燕等［13］認為腫瘤組織分化程度越高，ET-1表達越低，但該研究不支持此觀點，該研究的結果顯示，喉癌組織中ET-1表達與分化程度無關。

有研究證實，ET-1在卵巢癌、甲狀腺癌及肺癌中具有促血管生成作用［3，4，6］。該研究發現喉癌組織中ET-1表達與MVD密切相關，說明ET-1能夠促進喉癌組織中血管生成，從而增加喉癌侵襲和轉移的機會。ET-1是否能夠促進喉癌淋巴管生成，目前未見相關報道。本研究中喉癌組織中ET-1表達與LVD、淋巴管浸潤和淋巴結轉移密切相關，提示ET-1不僅可以促進喉癌血管生成，還可以促進喉癌淋巴管生成，加速喉癌細胞淋巴管浸潤與淋巴結轉移，其作用機制可能與ET-1表達增高能夠上調淋巴管生長因子血管內皮生長因子C和血管內皮生長因子D的表達，進而促進淋巴管生成有關［14］。

目前ET-1對腫瘤預后的相關報道尚不多見，且爭議較多。如Arun等［15］認為 ET-1、年齡與組織學分期可以影響大腸癌的預后，而Peeters等［16］發現，ET-1表達與大腸癌預后無關。Wulfing等［17］認為，ET-1的高表達與乳腺癌生存時間相關，但Yamashita等［18］發現，ET-1對乳腺癌生存時間并無影響。本試驗通過Kaplan-Meier生存分析繪出45例喉癌患者整體生存曲線，結果表明ET-1陽性表達與生存曲線不相關。然而，因為此研究是針對一組有限喉癌患者數量的回顧性研究，所以ET-1與喉癌預后的關系仍有待于進一步大樣本前瞻性的臨床研究。

綜上所述，ET-1不僅可以促進喉癌血管生成，也可以促進喉癌淋巴管生成和淋巴結轉移。ET-1在腫瘤血管生成和淋巴管生成中的作用及基于此的腫瘤抗血管和淋巴管生成的靶向治療將為人們開辟一條新的途徑。

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