HPLC法測定腎移植患者血清中內源性氫化可的松濃度

王曉杰，陳 榮（江蘇常州市第一人民醫院，常州市 213003）

糖皮質激素是最早使用的預防和治療腎移植排斥反應的藥物。從20世紀20－80年代，應用于腎移植的免疫抑制劑有了很大的發展，但激素作為基本藥物一直是不可替代的。目前糖皮質激素的給藥多依據個人經驗，而忽略不同患者之間的藥動學的差異。內源性糖皮質激素的變化可作為腎移植排斥反應的診斷及判斷排斥反應對糖皮質激素沖擊治療是否敏感的指標[1]。為此，筆者建立了測定腎移植患者血清中內源性氫化可的松濃度的方法，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統，包括2996紫外檢測器、1525雙泵、717自動進樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BT25S電子分析天平（德國塞多利斯公司，精密度:1×10－5g）；KTC-16H高速臺式離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；渦旋混合器（上海醫科大學儀器廠）。

1.2 試藥

可的松對照品（美國Sigma公司，含量:98%，批號:2007117）；氫化可的松對照品（美國Sigma公司，含量:98%，批號:035K1291）；內標:苯巴比妥對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:171222-200303）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾去離子水，其他試劑均為分析純。小牛血清（杭州四季青生物公司，批號:050516）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:迪馬Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-水-甲醇（51∶136∶77）；流速 :1.2mL·min－1；檢測波長:245 nm；柱溫:30 ℃；進樣量:30μL。該色譜條件下，血清中的雜質不影響氫化可的松的測定。氫化可的松及內標苯巴比妥的峰保留時間分別為12.2min和7.0min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.小牛血清+內標；B.健康者血清+氫化可的松對照品+可的松對照品；C.健康者血清+內標；D.腎移植患者血清+內標；1.苯巴比妥；2.可的松；3.氫化可的松Fig 1 HPLC chromatogramsA.bovine calf serum spiked with internal standard；B.human serum spiked with cortisol and cortisol；C.human serum spiked with internal standard；D.kidney-transplant recipients serum spiked with internal standard；1.phenobarbital；2.cortisone；3.cortisol

2.2 血清樣品的處理

取血清500μL，加入內標溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL和乙酸乙酯3mL，渦旋混合器振蕩1min后，4500 r·min－1離心15min，取上清液于尖底試管中，60℃水浴氮氣吹干，殘渣用甲醇50μL溶解，進樣30μL。

2.3 標準曲線的制備及最低檢測限

取小牛血清[2]500μL，加入內標溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL，再加入125μg·mL－1氫化可的松對照品溶液，使其濃度分別為50、100、150、200、250、300μg·L－1，按照“2.2”項下方法處理，測定樣品及內標的峰面積，以氫化可的松血藥濃度（X）為橫坐標，氫化可的松與內標的峰面積比（Y，其中氫化可的松與內標的峰面積比要減去小牛血清在氫化可的松處微小峰與內標的峰面積比）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為:Y＝0.1455X+0.01666（r＝0.9994）。結果表明，氫化可的松血藥濃度在50～300μg·L－1范圍內線性關系良好，根據信噪比（S/N）≥3計算氫化可的松的最低檢測限為8μg·L－1。

2.4 回收率試驗

配制低、中、高3種不同濃度（75、175、275μg·L－1）的氫化可的松血清樣品各3份，按照“2.2”項下方法處理，記錄峰面積，同時以相同量對照品溶液直接進樣的峰面積為對照，計算提取回收率。結果低、中、高3種濃度的提取回收率分別為（80.12±2.3）%、（79.77±3.5）% 、（75.48±4.5）%，3種濃度的提取回收率均＞70%。另測定樣品及內標的峰面積，計算其峰面積比值，代入標準曲線求出對應濃度，計算低、中、高3種濃度的方法回收率分別為（103.12±4.53）%、（100.77±4.07）% 、（101.61±6.92）%。

2.5 精密度試驗

配制低、中、高3種不同濃度氫化可的松標準血清各5份，按照“2.2”項下方法測定樣品及內標的峰面積，考察其日內及日間精密度，結果見表1。

2.6 穩定性試驗

配制低、中、高3種不同濃度的氫化可的松標準血清各5份，置－38℃冰箱中保存。按照“2.5”項下方法操作，在2周內完成穩定性試驗。結果3種濃度RSD均＜10%，提示樣品可于－38℃冰箱保存至少2周。

表1 精密度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

表1 精密度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

加入量/μg·L-1 75175275日內實測值/μg·L-1 77.34±3.39176.35±7.12279.43±19.04日內RSD/%4.394.046.81日間實測值/μg·L-1 77.13±7.06173.79±7.11280.27±14.26日間RSD/%9.164.095.09

2.7 腎移植患者血清中氫化可的松濃度測定

腎移植隨訪患者年齡17～62歲，平均41.6歲，術后腎功能穩定。腎移植術后均用環孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+潑尼松三聯用藥，所有受檢者于上午8∶00－8∶30時靜脈采血2mL進行檢測，結果顯示各組術后3個月以上腎移植患者內源性氫化可的松濃度逐漸穩定。腎移植患者氫化可的松水平檢測結果見表2。

表2 腎移植患者氫化可的松水平檢測結果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

表2 腎移植患者氫化可的松水平檢測結果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

內源性糖皮質激素腎移植患者氫化可的松濃度/μg·L-1 1～3個月（38例）31.89±21.423～6個月（30例）45.26±29.266～12個月（44例）49.69±22.00＞12個月（52例）53.56±29.86

3 討論

根據受體調節的下調（Downregulation）原則，血漿皮質醇濃度降低，淋巴細胞糖皮質激素受體水平增高，而淋巴細胞糖皮質激素受體水平增高的患者對外源性激素治療敏感[3]，提示內源性糖皮質激素的測定可能對排斥反應的診斷有幫助。器官移植中糖皮質激素在免疫及抗排斥反應中的作用機制，以及其對全身的影響還缺少深刻的認識，明顯落后于其他免疫移植藥物的研究。本組數據顯示腎移植術后腎功能穩定患者內源性糖皮質激素水平隨移植時間逐漸升高，術后3個月，患者的內源性氫化可的松濃度逐漸趨于穩定，平均為（52.15±25.58）μg·L－1，與文獻結果基本一致[4]。排斥患者數據是否存在差異則有待進一步探討。

本法的建立及腎移植術后內源性氫化可的松濃度的測定，為進一步研究及指導臨床使用糖皮質激素提供了理論依據。

[1]羅志剛，唐孝達，楊宇如，等.腎移植排斥反應時血糖皮質激素監測的意義[J].中華器官移植雜志，2001，22（3）:158.

[2]秦永平，余 勤，羅志剛.高效液相色譜法同時測定血清中氫化潑尼松和氫化可的松[J].藥物分析雜志，1995，15（4）:9.

[3]Morineau G，Boudi A，Barka A，et al.Radioimmunoassay of cortisone in serum，urine，and saliva to assess the status of the cortisol-cortisone shuttle[J].Clin Chem，1997，43（8 Pt 1）:1397.

[4]Oka K，Hirano T，Shimodaira H，et al.Suppression of endogenous cortisol for evaluating pharmacodynamics of prednisolone in early allograft rejection in renal transplantation[J].Clin Chem，1990，36（3）:481.