經熊去氧膽酸治療妊娠期肝內膽汁淤積癥孕婦血清膽汁酸譜分析Δ

凌玲，劉兆明，邵勇#，王富蘭(1.重慶市紅十字會醫院，重慶市40000；.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶市400016)

妊娠期肝內膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期特有的并發癥。ICP對胎兒影響較大，可發生胎兒窘迫和妊娠晚期不可預測的胎兒突然死亡。目前治療ICP的主要藥物是熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)和腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methione，SAMe)。國外大多推薦UDCA作為治療的一線藥物[1]。ICP最顯著的生化異常是血清中膽汁酸水平升高。人體內代謝的膽汁酸主要為5類游離型膽汁酸，即膽酸(Cholic acid，CA)、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)、去氧膽酸(Deoxycholic acid，DCA)、石膽酸(Lithocholic acid，LCA)和UDCA以及它們的甘氨(Glyco-，G)和牛磺(Tauro-，T)結合型膽汁酸[2]。ICP孕婦妊娠中晚期血清總膽汁酸明顯升高，其中以甘氨膽酸(GCA)和牛磺膽酸(TCA)為主的結合型膽汁酸升高最為顯著，游離型膽汁酸變化不大[3，4]。本研究采用高效液相色譜串聯質譜(High performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)法檢測UDCA治療ICP孕婦的血清膽汁酸譜的變化，為臨床的決策提供依據。

1 材料

1.1 儀器

API2000 HPLC-MS/MS儀，配備Perkin Elmer200泵和tubro離子源(加拿大Applied Biosystems公司)；Miliolpore真空泵和Waters part No WaT086344型吹氮裝置(美國Waters公司)；DL-1型固相萃取器(國家色譜研究分析中心)；LD5-2A離心機(北京醫用離心機廠)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Libroafl-200天平(日本Shimadzu公司)；SB-3200超聲波清洗器(寧波新芝科器研究所)；Modular 800全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 試藥

CA標準品(批號:81-25-4，純度≥98%)、CDCA標準品(批號:83-44-3，純度≥99%)、牛磺石膽酸(TLCA)標準品(批號:345909-26-4，純度≥95%)、LCA標準品(批號:434-13-9，純度≥97%)、UDCA標準品(批號:128-13-2，純度≥99%)、GCA標準品(批號:1192657-83-2，純度≥97%)、TCA標準品(批號:345908-23-1，純度≥95%)均購自美國Sigma-aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈、醋酸銨均為色譜純。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件[5]

色譜柱:菲羅門pH1-12柱(100 mm×2 mm，3 μm)；預柱:Luna C18(10 mm×2.0 mm，3 μm)；流動相:1/200乙酸水溶液(用氨水調節pH值至4.5)∶甲醇＝30∶70；流速:0.20 mL·min－1；柱溫:35℃。

電噴霧電離源(ESI)選擇性正離子檢測，選擇離子模式(SIM)方式檢測；干燥氮氣溫度:200℃，霧化器流量:1.5 L·min－1；檢測電壓:1.40 kV。

2.2 研究對象

ICP組20例，正常對照組15例。所有ICP孕婦分別于治療前及治療后4周采集空腹靜脈血5 mL，裝于無菌普通生化管內，立即將新鮮靜脈血標本在常溫、普通氣壓下3000 r·min－1離心15 min，吸取血清2 mL至凍存管內，放入－70℃低溫冰箱內凍存。檢測血清膽汁酸譜、甘膽酸和肝功能。本研究標本采集獲得重慶醫科大學醫學倫理委員會批準和受試者知情同意。

2.3 ICP診斷及納入、排除標準[6]

2.3.1 ICP診斷及納入標準:妊娠中晚期出現軀干、四肢等皮膚瘙癢，可伴或不伴黃疸；血清總膽汁酸(TBA)升高(＞10 μmol·L－1)，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)輕至中度升高(＞50 U·L－1)，總膽紅素(TBIL)及直接膽紅素(DBIL)正常或升高。

2.3.2 排除標準:肝膽B超排除肝膽疾病；乙肝病毒、丙肝病毒、巨細胞病毒和EB病毒標志物檢查排除病毒性肝炎；排除合并其他疾病者；分娩后上述癥狀、體征、生化指標迅速恢復正常。

2.4 ICP治療方案

所有ICP患者孕期26～32周入組，進入本研究前未行ICP藥物治療。治療前及治療4周后分別檢測肝功能和膽汁酸譜。ICP組患者口服UDCA(德國Losan Pharma GmbH公司，規格:每粒250 mg)250 mg，每日4次，2周為1個療程，本試驗共進行2個療程(4周)。治療前及治療后4周分別檢測肝功能和膽汁酸譜。HPLC-MS/MS檢測7種膽汁酸:CA、GCA、TLCA、TCA、UDCA、LCA、CDCA。

2.5 樣品預處理與測定[5]

取血清300 μL于1.5 mL離心管中，加入乙腈溶液700 μL，渦旋振蕩30 s，3000 r·min－1離心5 min，吸取上清液，吹干，加0.05%甲酸1.0 mL混合，用C18固相萃取柱萃取。用甲醇洗脫，60℃下氮氣吹干，殘渣用甲醇100 μL溶解，混勻，高速(15000 r·min－1)離心1.5 min。取20 μL進樣分析，檢測時間10 min。

2.6 方法學驗證

方法學驗證已有文獻報道[5]。

2.7 統計學分析

所得數據輸入SPSS16.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ICP治療組和正常對照組一般情況分析

ICP治療組年齡(29.18±1.97)歲，正常對照組年齡(28.14±2.98)歲，2組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

3.2 ICP治療前、后孕婦血清肝功能指標分析

ICP治療前與正常對照組相比較，TBA、ALT、AST、TBIL、DBIL有不同程度的升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；ICP治療前與ICP治療后比較ALT、AST、TBIL、DBIL顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.01)。

3.3 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜比較分析

ICP患者治療前的血清膽汁酸譜CA、GCA、TCA、LCA和TLCA分別為:(3.7±0.35)、(4.2±0.64)、(8.4±1.73)、(0.13±0.02)、(0.09±0.02)μmol·L－1，顯著高于正常對照組的(0.41±0.03)、(0.94±0.02)、(0.69±0.17)、(0.06±0.02)、(0.04±0.02)μmol·L－1，差異具有統計學意義(P＜0.05)；經UDCA治療后，CA和GCA下降至(1.29±0.17)、(1.86±0.47)μmol·L－1(P＜0.05)，TLCA和TCA顯著下降至(0.02±0.01)、(1.16±0.33)μmol·L－1(P＜0.01)，LCA無顯著下降，而UDCA與治療前比較升高了10倍(P＜0.01)；ICP經UDCA治療后與正常對照組比較，UDCA極顯著升高(P＜0.01)，CA、GCA、TCA分別有不同程度升高(P＜0.05)。ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析見表1。

表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

ICP治療前與正常對照組比較:＊P＜0.01，＃P＜0.05；ICP治療前與ICP治療后比較:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；ICP治療后與正常對照組比較:◆P＜0.01，□P＜0.05before treatment vs.control group:＊P＜0.01，＃P＜0.05；before treatment vs.after treatment:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；after treatment vs.control group:◆P＜0.01，□P＜0.05

TCA 8.40±1.73＊☆1.16±0.33□0.69±0.17組別ICP治療前ICP治療后正常對照組例數/n 202015 LCA 0.13±0.02＃0.09±0.030.06±0.02 UDCA 0.32±0.03☆3.19±0.43◆0.25±0.13 CDCA 0.43±0.010.37±0.140.35±0.02 CA 3.70±0.35＊Δ 1.29±0.17□0.41±0.03 GCA 4.2±0.64＊Δ 1.86±0.47□0.94±0.02 TLCA 0.09±0.02＃☆0.02±0.010.04±0.02

3.4 妊娠結局分析

與正常對照組相比，ICP治療組的羊水糞染率顯著升高(P＜0.05)；早產率和Apgar評分≤7，差異均無統計學意義(P＞0.05)。本研究均無圍生兒死亡發生。

4 討論

ICP藥物治療目標是緩解瘙癢癥狀，降低血膽酸濃度，改善肝功能，從而降低高膽酸血癥所致的胎兒窘迫和死胎的發生。UDCA通過內源性膽汁酸競爭，降低膽酸，改善胎兒環境從而延長胎齡，減輕瘙癢癥狀和降低生化指標，在膽汁中最具親水性，其治療ICP的機制主要有3方面:(1)保護膽管細胞免受疏水酸的細胞毒性作用，降低膽汁中膽汁酸的細胞毒性，降低膽管中疏水酸的濃度；(2)促進肝膽管的分泌，促進肝細胞膜上轉運器的攜帶、轉運功能；(3)保護肝細胞拮抗膽汁酸所誘導的細胞凋亡，抑制線粒體膜的轉運通透性，增加其主動轉運的能力[7～9]。Tribe等[2]研究發現，UDCA可以改善牛磺型和甘氨型疏水性膽汁酸的轉運途徑，從而使外周血中的牛磺型和甘氨型疏水性膽汁酸降低，減少肝細胞的損害，降低細胞的毒性作用。在本研究中，ICP患者接受UDCA治療后與治療前比較血清CA、GCA、TCA、TLCA均明顯下降。ICP治療前孕婦血清UDCA與正常對照組比較無明顯升高，但是經UDCA治療后，由于外源性UDCA的增加，治療后UDCA水平明顯升高，與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)。Brites等[10]研究發現，與正常妊娠孕婦相比，ICP治療前后LCA的濃度維持不變，但是LCA比例從(3.3±0.5)%增加到(7.4±1.3)%。與此不同的是，Lucangioli等[11]發現UDCA治療的ICP患者LCA和TBA濃度降低了，未接受UDCA治療的患者LCA濃度未改變，故認為LCA是更好的評價UDCA治療ICP效果的指標。在本研究中，ICP患者與正常對照組比較，LCA和TLCA均明顯升高，但在UDCA治療后TLCA明顯下降，LCA則無顯著下降。

ICP時，由于孕婦高膽汁酸血癥，膽汁酸鹽沉積于胎盤，胎盤滋養細胞出現細胞毒性改變，胎兒體內產生的代謝產物如膽汁酸通過胎盤轉運到母體的功能受到影響，而且母體血中呈高濃度膽汁酸狀態，使得膽汁酸由母體進入胎兒體內，胎兒血液中的膽汁酸水平異常聚集升高，膽汁酸可以通過被動擴散和鈉依賴載體主動轉運進入胎兒細胞內，可能引起胎兒細胞毒性改變[12]。大量臨床研究發現，ICP孕婦血液中膽汁酸水平愈高，胎兒窘迫發生率亦愈高。由此可見，膽汁酸對胎兒的不良影響是明顯的。UDCA通過降低母體血的高膽汁酸水平，減少了胎盤滋養細胞的毒性改變，從而改善胎兒環境，延長胎齡。在本研究中，ICP治療組的早產率和Apgar評分≤7，與正常對照組相比無差別，提示積極治療可以改善ICP患者圍生兒的預后。

本研究表明，UDCA治療ICP后，能顯著地降低ICP患者的高膽汁酸水平，其中CA、GCA、TCA、TLCA水平下降最為明顯。

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