丹參素誘導人肝癌細胞株SMMC7721凋亡的研究

畢明慧 陳 堅*

上海市徐匯區中心醫院老年病科1（200031） 復旦大學附屬華山醫院消化內科2

目前越來越多的研究證實具有抗氧化作用的中藥單體（如丹參素、丹參酮、銀杏黃酮、茶多酚等）對腫瘤治療和預防具有良好的效果[1～3]。丹參素是一種酚性芳香酸類化合物，具有明顯的抗炎、抗氧化作用。近年丹參素因其抗腫瘤活性而成為研究的熱點，但其具體作用機制仍未完全闡明。正常細胞的增殖、分化和凋亡處于平衡，而腫瘤細胞能無限增殖、分化受阻、凋亡受抑[4]，故誘導凋亡是腫瘤治療的重要途徑。本研究通過采用不同濃度的丹參素體外干預人肝癌細胞株SMMC7721，旨在分析其對肝癌細胞增殖、凋亡的作用，并初步探討作用機制。

材料與方法

一、細胞株、主要試劑和儀器

人肝癌細胞株SMMC7721購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

丹參素純品（純度>97%）購自復旦大學上海醫學院天然藥物化學教研室。取丹參素10 mg溶于5 ml PBS中后過濾除菌，4℃冰箱保存備用。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉錄酶購自Gibco公司。MTT試劑、Taq DNA聚合酶購自Promega（北京）生物技術有限公司。

美國Coulter公司EPICS Elite型流式細胞儀，日本JEOL公司JEM-1200EX透射電子顯微鏡，日本Olympus倒置相差顯微鏡，德國Biometra PCR儀。

二、實驗方法

1.細胞培養：將SMMC7721細胞加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期肝癌細胞，常規胰酶法消化、收集細胞，計數板計數細胞濃度。

2.MTT法：按每孔1×104密度接種于96孔板，每孔200μl。12 h待細胞貼壁良好后，加入含丹參素的培養基，丹參素的終濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L；以不加丹參素的培養基同等條件培養的細胞作為陰性對照組。培養24、48、72 h后，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20μl，37 ℃孵育4 h；棄上清液后加入 DMSO 150μl，振蕩 10 min。上酶標儀檢測各孔吸光度（A）值，檢測波長為490 nm。計算細胞生長抑制率，抑制率（%）=（對照組A值-實驗組A值）/對照組A值×100%。

3.細胞形態：取對數生長期SMMC7721細胞，加入終濃度為40 mg/L的丹參素，置于5%CO2培養箱繼續培養。每8 h倒置顯微鏡下觀察細胞形態。24 h后結束培養，制備切片，透射電子顯微鏡下觀察、拍片。

4.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡：取對數生長期SMMC7721細胞，加入含丹參素的培養基，使其終濃度分別為 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，培養24 h后收集細胞待測；另取對數生長期SMMC7721細胞，加入終濃度為40 mg/L的丹參素，分別于培養 0、12、24、36、48 h 后檢測細胞凋亡。上述藥物干預均以不加丹參素的細胞作為對照。胰酶法消化收集貼壁細胞，2000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸細胞，調整細胞濃度為 106/ml。 先后加入 10μl Annexin V-FITC 和 5μl PI，混勻后室溫避光孵育15 min；上流式細胞儀檢測。激發波長為488 nm，檢測波長為560 nm。

5.RT-PCR法檢測p53 mRNA表達：取生長良好的SMMC7721細胞，加入含丹參素的培養基，使其終濃度分別為 0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，24 h后收集細胞。以TRIzol一步法抽提總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR反應。各基因引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，p53 上 游 引 物 ：5’-GTG GCC TCT GTC ATC TTC CG-3’， 下 游 ：5’-CCG TCA CCA TCA GAG CAA CG-3’，片段長度291 bp；內參照β-actin上游引物：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，下游：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，片段長度 703 bp。PCR 反應體系 50μl，反應條件：94 ℃ 1 min；62 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；30個循環，最后72℃10 min。PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，自動凝膠成像分析系統掃描記錄圖像，測定光密度（OD）值，目的基因mRNA表達以p53條帶OD值與β-actin條帶OD值的比值來表示。

三、統計學分析

應用SPSS 10.0統計軟件。樣本率的比較采用χ2檢驗；多樣本均數比較用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞增殖

MTT法示，不同濃度的丹參素對SMMC7721細胞增殖均有抑制作用。10 mg/L丹參素即可抑制細胞生長，且隨著濃度的升高以及干預時間的延長，抑制效應明顯遞增（P<0.05），即丹參素呈時間和劑量依賴性地抑制SMMC7721細胞增殖（見圖1）。

圖1 不同濃度丹參素作用24、48和72 h后對SMMC7721細胞的抑制

二、細胞形態

40 mg/L丹參素作用8 h后，SMMC7721細胞貼壁能力下降，部分細胞皺縮、變圓，折光性升高；作用16 h后，細胞之間失去緊密聯接，小部分細胞漂浮；作用24 h后，大部分細胞漂浮，并可見細胞碎片。透射電子顯微鏡下示不同階段的典型凋亡細胞以及破碎的壞死細胞。早期凋亡細胞可見染色質邊集，在細胞核膜周邊形成新月體形（見圖2A）；隨之染色體發生固縮，DNA片段化，顯示電子密度增強的核碎片；細胞體積變小，胞質濃縮，但其內的細胞器仍保存較好；細胞膜保存完整，細胞膜表面微絨毛減少或消失；可見細胞膜芽生出泡現象。凋亡晚期可見核膜包裹的內含細胞器和細胞核碎片的凋亡小體（見圖2B）。

圖2 不同凋亡時期SMMC7721細胞的透射電子顯微鏡圖（×2000）

三、細胞凋亡

流式細胞術示作用24 h后，丹參素呈劑量依賴性地誘導SMMC7721細胞凋亡和壞死，其中40 mg/L丹參素的促凋亡作用最為明顯（見圖3）。

圖3 不同濃度丹參素作用24 h后SMMC7721細胞凋亡率和壞死率比較

40 mg/L丹參素作用SMMC7721細胞不同時間后，呈時間依賴性地誘導凋亡和壞死（見圖4），其中48 h時的作用最為明顯，SMMC7721細胞幾乎全部凋亡或壞死，且以凋亡為主要效應。

四、p53 mRNA表達

RT-PCR法示隨著丹參素干預SMMC7721細胞濃度的升高，p53 mRNA表達明顯上調（見圖5）。說明丹參素誘導SMMC7721細胞凋亡與p53基因表達有密切關系。

圖4 40 mg/L丹參素作用不同時間后SMMC7721細胞凋亡率和壞死率比較

圖5 不同濃度丹參素作用后p53 mRNA表達的PCR電泳圖

討 論

丹參素是一種新型的酚性芳香酸類化合物，早在1991年，Wu等[5]將分離自丹參氯仿提取物的15種成分作用于人鼻咽癌細胞株KB、人宮頸癌細胞株HeLa、人結腸癌細胞株COLO 205和人喉癌細胞株Hep-2，發現其對癌細胞均有不同程度的殺傷作用。楊華等[6]發現丹參素可通過阻滯細胞周期于G2/M期并誘導細胞凋亡而抑制胃癌MGC803細胞生長，且細胞中cyclin B1蛋白表達顯著下調，而caspase-3和caspase-6活性顯著升高。膽固醇是真核細胞生長分裂過程中必不可少的物質，方杰[7]發現丹參素能通過阻斷腫瘤細胞膽固醇合成而抑制乳腺癌細胞生長。但郭自強等[8]的研究發現丹參素能通過抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡而產生心肌保護作用；龐鶴等[9]證實丹參素可抑制缺氧/缺糖損傷所致的線粒體膜電位和活性的降低，從而具有穩定線粒體膜電位的作用，抑制神經細胞發生凋亡。由此可見，丹參素對不同類型的細胞凋亡具有相反作用，這可能由于腫瘤細胞的能量代謝和信號通路與正常細胞不同所致[10]。本研究中，丹參素可呈時間和劑量依賴性地抑制肝癌SMMC7721細胞的增殖，并時間和劑量依賴性地誘導SMMC7721細胞凋亡，與透射電子顯微鏡的結果一致。

腫瘤細胞的增殖和轉化過程均涉及氧自由基的增多；自由基可作為第二信使調節細胞蛋白激酶、轉錄因子活性、早期基因表達等，從而促進細胞增殖和轉化[11]。申亮等[1]應用量子化學法計算丹參素的O-H鍵解離焓和電離勢，并以此為理論指標評價其清除自由基的活性。結果顯示丹參素具有較高的清除自由基的活性。劉珊林等[12]證實丹參素能清除SMMC7721細胞的內源性活性氧，減少H2O2的產生，通過阻斷活性氧上調的PKB以及c-fos/cjun信號通路，從而抑制SMMC7721細胞的生長。

p53是一種抗癌基因，其高表達可誘導細胞凋亡。對正常細胞而言，p53所介導的細胞凋亡是對某些DNA損傷因子（如放射線、化療藥物等）的保護反應。p53的活化可通過誘導p21WAF1/CIP1基因表達增加，使細胞阻滯于G1/S期[13,14]；如DNA未得到及時修復，p53繼續誘導凋亡相關基因Bax表達增加[15]，使抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax之間的平衡失調，最終導致細胞凋亡[13,16]。本研究RT-PCR結果顯示，隨著丹參素濃度增強，p53基因表達顯著增強，說明丹參素干預可上調野生型p53表達。p53表達增強是丹參素促進細胞凋亡的潛在機制之一。但細胞凋亡過程存在一個復雜的調控網絡，由多種凋亡相關基因或信號通路參與并相互影響，因此有待進一步深入研究各信號途徑之間的相互聯系和作用。

綜上所述，丹參素在一定濃度范圍內呈時間和劑量依賴性地誘導肝癌細胞壞死和凋亡，其機制可能與p53表達上調有關。目前對丹參素的研究尚處于藥理觀察和臨床前期階段，今后應重點對其單體進一步純化和結構改造，同時深入研究其抗腫瘤作用的分子機制，以便能將丹參素等中藥單體開發成為一種新型的高效低毒的抗腫瘤藥物。

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