結腸腺瘤患者結腸黏膜5-HT表達和炎癥的初步研究*

胡 瑩 劉玉蘭 蔡春曉 楊 靜 朱元民

北京大學人民醫院消化內科（100044）

結腸腫瘤的發生、發展與腸道炎癥密切相關[1]。炎癥性腸病（IBD）是結腸癌發生的危險因素，IBD相關和散發性結腸癌的發生可能與菌群誘導的腸道低度炎癥相關[2]。結腸癌主要由結腸腺瘤發展而來，腺瘤易復發是其常見的臨床特點[3,4]，提示腺瘤患者結腸黏膜可能存在基礎病變。分布于腸黏膜上皮之間的腸嗜鉻（enterochromaffin,EC）細胞分泌的5-羥色胺（5-HT）與腸道炎癥密切相關，EC細胞和5-HT在腸道炎癥動物模型和IBD中表達增高[5]。5-HT與結腸腺瘤患者炎癥的關系尚未闡明。本研究通過檢測結腸腺瘤患者正常黏膜炎癥相關指標和5-HT表達相關指標，旨在證實腺瘤患者存在慢性炎癥并進一步探討5-HT與腺瘤患者腸道炎癥的關系。

材料與方法

一、患者來源

選取2009年3月～2010年1月北京大學人民醫院經結腸鏡和病理檢查確診的結腸腺瘤患者40例，并除外具有其他結腸急慢性炎性疾病以及其他部位活動性炎癥者。其中男27例，女13例；年齡39～74 歲，平均（61.2±10.0）歲；進展期腺瘤 14 例，非進展期腺瘤26例。同時選取同期17例結腸鏡檢查無異常者作為對照，并且3個月內無急性腹瀉史、其他部位無活動性炎癥以及無糖尿病、結腸腫瘤家族史、體重指數小于25。其中男11例，女6 例；年齡 23～60 歲，平均（38.9±11.3）歲。所有研究對象均知情同意。

結腸腺瘤患者在結腸鏡下取正常黏膜組織（至少距腺瘤5 cm以上），對照組分別取升結腸和降結腸正常黏膜組織。部分組織液氮－80℃保存待測；其余置于4%甲醛溶液固定，制備石蠟包埋標本。

二、主要試劑

即用型鼠抗人嗜鉻素A（CgA）抗體、兔抗人CD3多克隆抗體、鼠兔通用型二抗試劑盒（基因有限公司）；兔抗人5-HT多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；逆轉錄酶（Invitrogen公司）；實時定量SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO 公司）。

三、研究方法

1.免疫組化法：石蠟切片置于新鮮配制的3%H2O2中，室溫10 min，消除內源性過氧化物酶活性。CD3和CgA染色行抗原修復（pH值為9.0的1 mmol/L Tris-EDTA水浴加熱修復20 min），5-HT染色無需抗原修復。滴加5%的胎牛血清室溫孵育20 min。分別滴加即用型兔抗人CD3多克隆抗體、兔抗人5-HT多克隆抗體、鼠抗人CgA抗體，4℃過夜；滴加二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為空白對照。

結果判斷：參照Kim等[6]的方法，每張切片選取3個視野，高倍（×400）顯微鏡下選取100個結腸上皮細胞，計數上皮內淋巴細胞、固有層CD3+T細胞、5-HT陽性EC細胞和CgA陽性EC細胞，取均值。

2.實時熒光定量PCR：參照試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄為cDNA。各目的基因腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環氧合酶-2（COX-2）、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）、色氨酸羥化酶 1（TpH1）PCR 引物由Invitrogen公司合成（見表1）。PCR反應體系為20μl，反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72℃30 s；共 35個循環。采用BIO-RAD公司實時定量PCR儀，Opticon Monitor 3軟件分析所得數據，目的基因相對表達量的分析采用2-△CT法。

表1 PCR引物序列和擴增片段長度

四、統計學分析

結 果

一、結腸黏膜炎癥指標

腺瘤組患者正常黏膜固有層CD3+T細胞計數較對照組顯著增高（P<0.05），上皮內淋巴細胞計數與對照組相比無明顯差異（P>0.05）（見表 2、圖 1）。腺瘤組患者正常黏膜 TNF-α、COX-2、iNOS mRNA表達顯著高于對照組（P<0.05）（見表2）。

二、結腸黏膜神經內分泌相關指標

結腸腺瘤患者正常黏膜5-HT陽性EC細胞計數、CgA陽性EC細胞計數以及TpH1 mRNA表達較對照組顯著增高（P<0.05）（見圖 1、表 3）。

三、炎癥相關因子mRNA表達與TpH1 mRNA表達的相關性

結腸腺瘤患者正常黏膜 TNF-α、COX-2和iNOS mRNA表達均與TpH1 mRNA表達呈正相關（r=0.373，P=0.007；r=0.539，P<0.001；r=0.539，P<0.001）。

表2 腺瘤組和對照組結腸黏膜炎癥相關指標比較（ ）

表2 腺瘤組和對照組結腸黏膜炎癥相關指標比較（ ）

組 別 例數 上皮內淋巴細胞 固有層CD3+T細胞 TNF-α mRNA COX-2 mRNA iNOS mRNA腺瘤組 40 15.13±0.62 57.16±2.33 0.034±0.005 0.089±0.025 0.388±0.090對照組 17 13.56±0.69 40.39±2.15 0.016±0.002 0.028±0.007 0.179±0.031 P值 0.175 0.003 0.001 0.011 0.046

圖1 腺瘤組和對照組免疫組化染色圖（×400）

表3 腺瘤組和對照組結腸黏膜神經內分泌相關指標比較（ ）

表3 腺瘤組和對照組結腸黏膜神經內分泌相關指標比較（ ）

組 別 例數 5-HT陽性EC細胞CgA陽性EC細胞 TpH1 mRNA腺瘤組 40 4.64±0.31 7.59±0.47 1.533±0.441對照組 17 2.81±0.43 4.98±0.44 0.830±0.451 P值 0.003 0.001 0.006

討 論

19世紀，Virchow在腫瘤組織中發現白細胞，首次提出腫瘤可能起源于慢性炎癥[7]。約25%的惡性腫瘤與慢性炎癥和感染密切相關[8]。結腸腫瘤的發生和發展亦與炎癥相關，Uronis等[9]的動物實驗表明慢性結腸炎的嚴重程度與結直腸腫瘤的發生直接相關，且細菌導致的炎癥促使腺瘤向腺癌發展。潰瘍性結腸炎患者發病10年、20年、30年的結直腸癌發生率分別為2%、8%和18%；且結腸鏡或組織學炎癥程度越重，結直腸癌的發生風險越高[10]。多項研究[11,12]發現散發性結腸腺瘤患者正常黏膜存在慢性炎癥，提示慢性炎癥可能是結腸腺瘤的瘤前病變。本研究中，與對照組相比，結腸腺瘤患者正常結腸黏膜固有層CD3+T細胞明顯增多，炎癥相關因子 TNF-α、COX-2、iNOS mRNA 表達亦明顯增高，說明結腸腺瘤患者正常黏膜存在慢性炎癥。結腸腫瘤的發生是一個漫長的過程，高脂飲食、肥胖、年齡、感染、腸道菌群紊亂等是其危險因素，且可能與腸道慢性炎癥相關，但需進一步研究證實。

腸道暴露于大量食物、微生物、毒物等外源性抗原中，腸道免疫系統、神經內分泌系統的共同調控使腸道處于動態穩態。當腸道黏膜穩態失衡時，即可導致慢性炎癥。CgA為神經內分泌細胞公認的標記物[13]。分布于胃腸道的神經內分泌細胞根據其分泌激素的不同分為14種亞型，5-HT的EC細胞是胃腸道分布最廣泛、數量最多的神經內分泌細胞[14]。5-HT與IBD、腸道感染、腸易激綜合征以及結腸癌發生相關；5-HT可活化免疫細胞釋放炎癥介質，而CD4+T細胞分泌的產物可促進EC細胞產生5-HT；5-HT釋放后，由5-HT再攝取轉運體（SERT）轉運至腸道上皮細胞之后被降解[5]。Haub等[15]研究表明SERT基因缺失導致5-HT再攝取減少后，小鼠結腸炎加重。TpH1是5-HT合成的限速酶，主要表達于EC細胞。Ghia等[16]的研究發現TpH1基因缺失導致腸道5-HT合成減少，可減輕DSS誘導的小鼠結腸炎，提示5-HT參與腸道炎癥過程。Ataee等[17]表明5-HT激動劑促進結腸癌細胞株HT29增殖，而5-HT3和5-HT4受體拮抗劑抑制HT29細胞增殖，且5-HT3和5-HT4受體在結腸癌組織中表達增高。說明5-HT可能參與結腸腫瘤的發生、發展。Nocito等[18]的研究表明TpH1基因敲除小鼠結腸腫瘤生長緩慢。本研究中，腺瘤組患者正常黏膜5-HT陽性EC細胞和CgA陽性EC細胞較對照組增多，TpH1 mRNA表達增高，并與炎癥相關因子mRNA表達呈正相關。說明結腸腺瘤患者正常黏膜EC細胞增多，5-HT合成增多，并與腺瘤患者結腸黏膜炎癥相關。

Balkwill等[19]提出腫瘤發生的“達爾文微環境”，即腫瘤組織會選擇最適合腫瘤發生和發展的炎癥類型和程度。免疫細胞、細胞因子以及免疫介質在結腸腫瘤的發生、發展、轉移過程中起重要作用[1]。本研究初步提示，結腸腺瘤患者正常黏膜存在炎癥，其機制可能與腸道5-HT合成增加相關。說明5-HT作用環節可能作為結腸腫瘤診斷、預防、治療新的靶點，但需行進一步更深入的研究證實。

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