Myostatin重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質量和力量的影響

唐量 張萬金 王園麗 張英起

1 陜西師范大學體育學院運動分子生物學實驗室（西安 710062） 2 第四軍醫大學生物技術中心

運動和藥物治療多年來一直是臨床預防和治療肌萎縮的重要方法。除研究不同運動如耐力訓練、抗阻力訓練或被動運動訓練等治療肌肉萎縮的方法及機制外，尋找新的藥物靶分子也十分必要。最近的實驗證明，肌肉萎縮與Myostatin異常表達升高密切相關。Lalani等［1］對雄性成年大鼠進行17d模擬失重后證實，股二頭肌、股四頭肌、腓腸肌Myostatin mRNA和蛋白水平顯著高于對照組。Michelle等［2］對Wistar大鼠進行10d后肢懸吊，發現Myostatin mRNA升高110%，蛋白水平上升37%。人體實驗證明，成年男性臥床25d，伴隨著瘦體重、肌肉量下降，血液Myostatin濃度高于基礎值12%［3］。以上研究說明模擬失重、后肢懸吊或臥床等誘發的廢用性肌肉萎縮可引起肌肉組織Myostatin表達異常升高，但針對Myostatin靶分子治療廢用性肌肉萎縮方面的研究報道仍少見。

Myostatin是骨骼肌生長發育的主要負調控因子，屬于TGF-β超家族新成員，因其基因敲除后出現“雙肌”癥狀［4］而倍受關注。目前眾多研究報道了抗阻力運動［5，6］和游泳訓練［7］等對Myostatin基因和蛋白表達的影響，證明抗阻力訓練和耐力訓練使肌肉肥大與Myostatin關系密切。本課題組近年來報道了Myostatin對骨骼肌生長發育調控的研究進展［8］和Myostatin基因多態性在杰出運動員選材中的應用展望［9］，但有關蛋白水平上Myostatin活性抑制對骨骼肌質量和力量影響的報道還少見。要準確了解運動或Myostatin抑制劑干預Myostatin活性在肌肉形成中的作用機制，蛋白水平上的研究尤為重要。我們前期已利用基因工程技術構建、表達和純化了高純度、無活性的Myostatin重組蛋白［10］，本實驗以Myostatin重組蛋白作為疫苗免疫小鼠，觀測小鼠體重、肌細胞形態、骨骼肌質量和力量等指標的變化，探討Myostatin蛋白疫苗調控骨骼肌質量和力量的效果及分子機制。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

實驗動物為雄性BALB/c小鼠，體重12～14g，共20只，購自第四軍醫大學實驗動物中心。20只小鼠分成正常對照組和His-Ms免疫組2組，每組10只。小鼠飼養環境保持高度清潔，自然光照，自由飲水和進食，動物室溫23～28℃，相對濕度50%～65%。適應性喂養1周后His-Ms組小鼠進行免疫實驗。

1.2 免疫方案和體重

免疫蛋白His-Ms為基因工程技術構建、表達和純化的高純度、無活性的Myostatin重組蛋白［10］。His-Ms 組小鼠按100 μg/只劑量進行腹腔注射，每兩周免疫1次，共免疫4次［11］。正常對照組動物在實驗組進行免疫時腹腔注射相等體積的生理鹽水。實驗期間，每周一、四早上10:00稱體重，取兩次稱重的平均值為每周體重。

1.3 取材

實驗共進行62 d，最后一次免疫20 d后對照組和His-Ms組小鼠同時取材，眼眶采集血樣，然后迅速取出腹腔內的游離脂肪組織稱重，再分離股四頭肌、腓腸肌和胸大肌，剝離附著在肌肉組織的包膜等非肌纖維組織，稱重并記錄。

1.4 骨骼肌形態分析

分離肌肉組織，在4℃固定液（10%中性福爾馬林，50 mmol/L PBS，pH7.2）中固定24 h，后在肌中間最隆起部位切片，置于4℃溶液（5%蔗糖，50 mmol/L PBS，pH7.2）中過夜，預冷的50%丙酮脫水，純丙酮脫水2次，二甲苯透明，浸蠟，石蠟（54℃～56℃）包埋，切片，HE（hematoxylin and eosin）染色，生物顯微鏡（Olympus IX70， 日本Olympus公司）觀察。為分析小鼠肌肉組織重量增加與肌細胞肥大（hypertrophy）或肌細胞增生（hyperplasia）之間的關聯，實驗利用Scion Image4.02軟 件（http：//www.scioncorp.com）， 從對每組隨意選6只小鼠共1000個股四頭肌細胞的橫斷面積和每束肌纖維的平均細胞數，按Lee等［12］報道的方法進行統計分析。

1.5 血清常規指標測定

采用全自動生化分析儀（日本日立公司）檢測血清膽固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、尿素氮（BUN）、血糖（GLU）、肌酸激酶（CK）等血液指標。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 抓力測試

小鼠處死前1d對其前肢抓力進行測試。參考并改進Peled-Kamar等［13］報道的前肢抓力測試方法，在離地高80 cm處綁緊一根直徑2 mm的繩子，讓小鼠前肢握住繩子，并固定尾部，記錄小鼠掉落前持續握住繩子的時間，即完成一次抓力測試。重復3次取平均值。抓力測試重復間隔時間盡可能一致。

1.7 細胞ELISA測定小鼠蛋白疫苗血清抗體滴度

利用PVAC-Ms轉染并鑒定可表達Myostatin蛋白的CHO細胞［14］，轉染36h后，吸去培養液，37℃干燥后用0.025%戊二醛（PBS配制，pH7.4）室溫固定20 min，PBS洗孔3遍。每孔加入200 μl含3% H2O2PBS，室溫反應20 min，PBS洗孔3遍。在細胞包被孔中分別加入兩組各6只小鼠不同稀釋度的待測血清，每孔200 μl，設復孔，陰性對照，37℃溫箱反應l h，用洗液洗3遍。加入1:10000生物素化的羊抗小鼠IgG抗體，每孔200 μl，37℃反應l h，洗孔3遍，甩干。加入1:200親和素化辣根過氧化物酶，每孔200 μl，37℃反應30 min，洗孔3遍。加OPD-H2O2底物200 μl，37℃避光反應，加2M H2SO4終止反應。酶標儀（美國Bio-Rad公司）測各孔OD450nm值。

1.8 統計學分析

用Excel 2000對所測數據進行統計處理，實驗結果以均數±標準差（）表示，進行兩組間非成對均值t檢驗，P < 0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 小鼠體重變化和組織重量比較

由圖1可見，第6周開始至實驗結束，His-Ms組免疫小鼠體重增加幅度略大于正常對照組。表1顯示， His-Ms組小鼠最后一周體重與正常對照組比較平均增加3.6%，但無統計學意義。與正常對照組比較，His-Ms組小鼠股四頭肌和胸大肌重量顯著增加，腓腸肌重量雖增加但無顯著性差異；腹腔脂肪墊重量無顯著性變化。

表1 兩組小鼠體重、肌肉和腹腔脂肪墊重量比較

2.2 小鼠骨骼肌細胞顯微結構

股四頭肌組織化學染色光鏡觀察結果顯示，對照組和His-Ms組小鼠肌細胞形態均正常，細胞結構完整（圖2A）。與對照組比較，His-Ms組小鼠股四頭肌橫斷面積增加了5.6%，有統計學意義（圖2B），而股四頭肌每束肌纖維平均細胞數目兩組之間無明顯差別（圖2C）。

2.3 小鼠血清指標

表2顯示，各血清指標兩組之間無顯著差別。

2.4 小鼠前肢抓力測試

正常對照組前肢抓力測試時間為33.5±2.7 s，His-Ms組為46.5±7.0 s，與正常對照組比較增加了26.6%，差異顯著（P<0.05）。

2.5 小鼠血清平均抗體滴度

表2 兩組小鼠血清指標的變化

圖3顯示，在血清稀釋2×102倍時，對照組OD450nm值為0.363，His-Ms組 OD450nm值為 0.794，His-Ms組與對照組OD450nm比值大于2.1，由此判斷血清抗體為陽性；而在血清稀釋2×103和2×104倍時，His-Ms組與對照組的OD450nm比值小于2.1，判斷血清抗體為陰性，表明His-Ms蛋白免疫小鼠后抗體效價達到2×102。

3 討論

本實驗結果顯示，針對Myostatin的免疫蛋白誘導的特異性抗體平均滴度在2×102以上，并對免疫小鼠體重、肌肉質量和抓力均產生影響。與正常對照組比較，免疫小鼠體重平均增加了3.6%，股四頭肌、腓腸肌和胸大肌重量分別增加了11.2%、3.2%和15.8%，前肢抓力平均增加了26.6%，而小鼠腹腔游離脂肪組織和血清CHO、TG各組之間無明顯差別，推測免疫小鼠體重增加可能與肌肉重量增加有關，與脂肪堆積無明顯關聯。本實驗中，與正常對照組比較，His-Ms組免疫小鼠股四頭肌橫斷面積增加了5.6%，而股四頭肌每束肌纖維平均細胞數目兩組之間無明顯差別，初步表明免疫小鼠骨骼肌質量增加可能與骨骼肌肥大有關，而與肌細胞增生無明顯關聯。Whittemore等［15］研究證明，成年小鼠注射抗Myostatin抗體后，肌肉質量和抓力顯著增加，與本實驗結果基本一致。但Myostatin重組蛋白疫苗克服了抗體類藥物價格昂貴、用藥量大、長期反復、易引起超敏反應等缺點，是抑制體內Myostatin活性的一種新途徑，易于在肌肉萎縮的臨床治療中應用。我們前期有關 Myostatin自體疫苗的制備及臨床前基礎研究成果已獲發明專利授權（No. 200610104728.4）。

本實驗中，無活性Myostatin免疫蛋白使小鼠骨骼肌質量和力量增加可能與免疫誘導的抗體和 Myostatin特異性結合進而抑制其活性有關。Myostatin成熟肽包含9個保守的半胱氨酸殘基，在血液中通過二硫鍵連接形成二聚體，活化的Myostatin以二聚體形式與受體結合發揮該蛋白的生物學功能［16］。目前證實能與Myostatin成熟肽結合并抑制其活性的分子有其前肽、Follistatin、Follistatin-related gene（FLRG）及其受體Act RIIB拮抗劑等，肌肉表型與Myostatin基因敲除動物的類似［9，17］。實驗誘導的特異性抗體與 Myostatin 二聚體結合，可競爭性抑制該分子與受體的結合而封閉其作用，相關的理論推測需要下一步競爭性抑制實驗來證實。

運動使骨骼肌負調控因子Myostatin基因表達趨于下調，同時促進骨骼肌正調控因子IGF-I表達趨于上調［18，19］，但也有不一致的報道［3］。Zdanowicz等［20］利用IGF-I治療后肢懸吊10d的廢用性肌萎縮大鼠模型后發現，大鼠體質量和肌質量顯著恢復，對治療廢用性肌肉萎縮有效。而有關Myostatin在治療廢用性肌肉萎縮方面的研究仍少見，本實驗結果為Myostatin靶分子應用于廢用性等肌肉萎縮的治療提供了實驗參考，并為航空航天醫學中研究失重性肌肉萎縮的難題提供了新思路。

4 總結

利用基因工程技術構建、表達和純化的無活性His-Ms蛋白免疫小鼠后，可誘導其產生特異性抗體，使免疫小鼠瘦體重、骨骼肌質量及抓力均有不同程度增加，表明Myostatin重組蛋白疫苗His-Ms是抑制體內Myostatin活性的一種新途徑，對動物骨骼肌質量和力量增加有一定促進作用。

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