不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠骨骼肌線粒體融合分裂基因及Mfn2、Drp1蛋白表達(dá)的影響

漆正堂 郭維 張媛 賀杰 丁樹哲

1 華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海 200241） 2 杭州體育科學(xué)研究所

細(xì)胞生命過程中，線粒體管網(wǎng)進(jìn)行著不間斷地分裂和融合，二者維持動(dòng)態(tài)平衡對(duì)細(xì)胞積極而靈敏地適應(yīng)環(huán)境具有重要意義［1］。執(zhí)行線粒體融合與分裂的基因和蛋白已被發(fā)現(xiàn)，Mfn1/2和OPA1是線粒體融合所必需的，融合基因缺陷可導(dǎo)致線粒體片段化；hFis1和Drp1是線粒體分裂所必需的，分裂基因缺陷可導(dǎo)致線粒體管網(wǎng)化［2］。研究還發(fā)現(xiàn)，Mfn1/2、OPA1和Drp1是GTP結(jié)合蛋白，具有GTPase活性；hFis1無GTPase活性。Mfn1/2、OPA1和Drp1水解GTP，使自身蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，對(duì)線粒體融合分裂是必需的。Mfn1/2、OPA1、Drp1、hFis1都是線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)力學(xué)變化的直接執(zhí)行者［3］。

此前，已有少數(shù)研究關(guān)注過運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體融合基因表達(dá)的影響，觀測點(diǎn)主要有兩種。一是觀測線粒體融合基因相對(duì)于急性運(yùn)動(dòng)的時(shí)相性表達(dá)。Cartoni等研究表明，Mfn1、Mfn2的mRNA表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)顯著上調(diào)，Mfn2基因表達(dá)可能受PGC-1α/ERRα驅(qū)動(dòng)［4］。孫衛(wèi)東等報(bào)道Mfn1/2 mRNA表達(dá)在一次遞增負(fù)荷急性運(yùn)動(dòng)中和運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期呈現(xiàn)類似超量恢復(fù)的時(shí)相性變化［5］。急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌Mfn1/2 mRNA表達(dá)逐漸減少，恢復(fù)期骨骼肌Mfn1/2 mRNA表達(dá)水平逐漸增加直至超過運(yùn)動(dòng)前的安靜水平，說明線粒體融合基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)是線粒體對(duì)細(xì)胞能量需求急增的一種快速應(yīng)答反應(yīng)。二是觀測線粒體融合基因相對(duì)于長期運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性表達(dá)。健康人經(jīng)過一定時(shí)期體育鍛煉后，Mfn2基因的轉(zhuǎn)錄水平與肌肉的氧化磷酸化活性和PGC-1α mRNA密切正相關(guān)［6］。運(yùn)動(dòng)和減體重上調(diào)Mfn2表達(dá)，肥胖、糖尿病、TNFα/IL-6暴露則下調(diào)Mfn2表達(dá)［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，長期運(yùn)動(dòng)可上調(diào)健康人Mfn1/2基因表達(dá)，但對(duì)糖尿病人無此功效［8］，表明線粒體融合基因?qū)\(yùn)動(dòng)的應(yīng)答與機(jī)體病理狀態(tài)也有關(guān)。機(jī)體運(yùn)動(dòng)的主要特征包含骨骼肌收縮力量和（或）收縮頻率的增加，線粒體的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)具有運(yùn)動(dòng)方式的特異性［9］。大部分研究支持長時(shí)間低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)是誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生的主要運(yùn)動(dòng)方式，力量練習(xí)是誘導(dǎo)骨骼肌蛋白合成增加、體積質(zhì)量增長的主要運(yùn)動(dòng)方式。大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)在肌肉收縮力量與收縮頻率上與以上運(yùn)動(dòng)方式都有顯著差異。本研究假設(shè)骨骼肌線粒體融合分裂基因與蛋白表達(dá)可能受到不同運(yùn)動(dòng)方式的影響。本研究通過比較長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)和大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體融合分裂基因與蛋白表達(dá)的影響，探討不同運(yùn)動(dòng)方式下線粒體管網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的動(dòng)力學(xué)差異，進(jìn)一步揭示線粒體運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的特異性以及運(yùn)動(dòng)防控線粒體疾病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠30只，約5周齡，體重133.4±9.5 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2004-0001。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料及墊料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，自由飲食，飼料供給量根據(jù)體重增長相應(yīng)增加，每周更換墊料2～3次，環(huán)境溫度20～23℃，相對(duì)濕度50～70%，自然光照。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen；cDNA第一鏈合成試劑盒購自Promega；SYBR green PCR MasterMix購自TOYOBO。Western Blot常規(guī)試劑購自上海生工，一抗、二抗購自Santa Cruz，PVDF膜購自Milipoler。酶標(biāo)儀：Tecan Infinite M200型；Real-time PCR儀：Applied Biosystem StepOne型；離心機(jī)：Eppendorf 5804/R型；電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀：BIO-RAD；凝膠成像儀：TANON GIS-2008。

1.3 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

30只大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為3組，即安靜對(duì)照組（Con），耐力運(yùn)動(dòng)組（ET），間歇性運(yùn)動(dòng)組（SIT），每組10只。ET組運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不高于16.7 m/min（< 60%VO2max），第1周運(yùn)動(dòng)時(shí)間30 min/天，第2～4周40 min/天，第5～8周60 min/天，坡度均為0。SIT組執(zhí)行大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)方案，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不低于42 m/min（>100%VO2max），每日進(jìn)行9～10次10 s沖刺跑，次間間歇30～60 s，每完成3次間歇3 min；第1～2周坡度為0，第3～4周為5%，第5～8周為10%。ET和SIT組進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練8周，訓(xùn)練時(shí)段為晚間18:30～22:00，周日停訓(xùn)一次。

1.4 取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后休息24 h，大鼠斷頸處死。在20 min內(nèi)分別取完整的左右下肢腓腸肌，切分若干份后置于液氮中速凍，－70℃超低溫冰箱保存，待檢測。

1.5 Real-time PCR

取腓腸肌樣品100 mg左右，RNA抽提參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行。取9.5 μl總RNA（約含RNA 0.5 pg～1 μg），以oligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行cDNA合成。

PCR按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：2×SYBR green PCR MasterMix（SYBR green I、HotStart Taq DNA Polymerase、Reaction Buffer、dNTP、Mg2+）10 μl，上下游引物各 1μl，ddH2O 4 μl，模板 cDNA 4 μl，總體積20 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，1 min）；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15 s；61℃，30 s；72℃，45 s，收集熒光）。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，再變性（95℃，75 s），退火（55℃，60 s），然后從55℃緩慢加熱到95℃，15 s；每1℃收集熒光。熔解曲線只顯示一個(gè)主波峰，說明PCR擴(kuò)增的特異性較高，符合熒光定量PCR的技術(shù)要求。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增引物見表1，引物序列查自NCBI數(shù)據(jù)庫，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

1.6 Western Blot

取100 mg腓腸肌組織放入小燒杯中，加入1 ml提前預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（甘露醇210 mM，蔗糖70 mM，Tris-HCl 5 mM，EDTA 1 mM，PMSF 0.1 mM，DTT 0.5 mM）；剪碎肌組織，盡量去除結(jié)締組織、脂肪等；電動(dòng)勻漿，勻漿液倒入離心管①，1300g 4℃離心10 min；吸上清到離心管②，將上清17,000g 4℃離心15 min；抽吸棄去上清，同時(shí)保留沉淀（線粒體），加入1 ml勻漿介質(zhì)，重懸；重懸液17,000g 4℃離心15 min；抽吸棄去上清，保留沉淀（線粒體），加入0.5 ml勻漿介質(zhì)，重懸，即線粒體蛋白樣品。采用BCA法測定蛋白含量。

將樣品稀釋至相同蛋白含量，取100 μl樣品加入 5×SDS上樣 buffer，95℃處理 10 min。每孔加樣30 μl。接通電源，以電壓120 V、電流60 mA電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將膜在一抗中孵育，4℃過夜（一抗溶于封閉液，1:200稀釋）；用TTBS洗三次，每次輕搖10 min；在二抗（1:2000用封閉液稀釋）中孵育1 h；用TTBS洗三次，每次輕搖10 min。用DAB 顯色，用TANON GIS-2008凝膠成像儀拍照并用天能GIS 凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，靶蛋白與內(nèi)參蛋白條帶（VDAC1，線粒體外膜蛋白）的密度之比作為靶蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌Mfn1/2、OPA1、Drp1、hFis1 mRNA表達(dá)

如圖1所示：ET組Mfn1 mRNA表達(dá)顯著高于Con組（P < 0.05），但SIT組與ET組之間無顯著差異。SIT組Mfn2 mRNA表達(dá)顯著低于Con組 （ P < 0.05），但SIT組與ET組之間無顯著差異。SIT組OPA1 mRNA表達(dá)顯著高于ET組（P < 0.05）。SIT組Drp1 mRNA表達(dá)顯著高于Con組（P < 0.05）和ET組（P < 0.01）。與Con比較，ET組和SIT組hFis1 mRNA表達(dá)均無顯著變化。

2.2 各組大鼠骨骼肌線粒體Mfn2、Drp1蛋白水平

如圖2所示：SIT組線粒體Mfn2蛋白表達(dá)顯著高于Con組（P < 0.05），但SIT組與ET組之間無顯著差異。SIT組線粒體Drp1蛋白表達(dá)顯著低于Con組和ET組（P < 0.05）。

3 討論

線粒體的總體形態(tài)（管網(wǎng)狀或片段化）依賴于融合、分裂蛋白的相對(duì)活性。線粒體空間形態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化與線粒體代謝、氧化磷酸化、肌肉生物發(fā)生以及線粒體疾病的發(fā)生都密切相關(guān)。Mfn1/2異常表達(dá)與Charcot-Marie-Tooth 2A型神經(jīng)病（CMT2A）、肥胖、糖尿病、胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，對(duì)神經(jīng)、骨骼肌病變有重要病理意義。抑制Mfn2基因?qū)е戮€粒體管網(wǎng)脆裂，功能受損，葡萄糖氧化、線粒體膜電位、細(xì)胞呼吸和線粒體質(zhì)子漏均下降；三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈被抑制，細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)為糖酵解，糖原合成率下降［10，11］。而Mfn2過度表達(dá)則引起呼吸鏈復(fù)合物、線粒體氧化和細(xì)胞糖原利用增加［12］。哺乳動(dòng)物肌肉發(fā)生時(shí)Mfn2基因被顯著誘導(dǎo)，幫助維持和更新線粒體管網(wǎng)。阻斷小鼠Mfn1和Mfn2基因表達(dá)將導(dǎo)致骨骼肌嚴(yán)重缺失，小鼠存活年齡僅2個(gè)月左右，肌肉質(zhì)量、橫截面積以及肌纖維寬度均驟減［13］。Zucker肥胖鼠、肥胖人和糖尿病病人中Mfn2蛋白和mRNA表達(dá)均降低，提示線粒體融合分裂調(diào)節(jié)異常參與了胰島素抵抗的發(fā)生［7］。正常的線粒體融合對(duì)于mtDNA穩(wěn)定性、線粒體的細(xì)胞定位與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)都是必須的［14-16］；Mfn1/2對(duì)不同生理刺激能產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)水平的應(yīng)答。因此，研究不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)骨骼肌Mfn1/2、OPA1表達(dá)的影響可為運(yùn)動(dòng)干預(yù)、治療相關(guān)疾病提供分子依據(jù)和鍛煉策略。

本研究旨在觀察骨骼肌線粒體融合基因相對(duì)于長期運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性表達(dá)，重在比較長時(shí)間低強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)與大強(qiáng)度、間歇性運(yùn)動(dòng)效果的差異。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)Mfn1 mRNA表達(dá)（P < 0.05），但Mfn2的mRNA以及線粒體Mfn2的蛋白表達(dá)對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)均表現(xiàn)沉默。許多研究提示，Mfn1功能相對(duì)單一，主要參與線粒體融合的執(zhí)行過程；盡管Mfn1、Mfn2對(duì)于線粒體融合都是必不可少的，但Mfn2在更多情況下都參與了線粒體代謝調(diào)節(jié)與線粒體疾病的發(fā)生，甚至可以認(rèn)為Mfn2是一個(gè)比較重要的代謝調(diào)節(jié)因子［11，12，17］。從Mfn1、Mfn2、OPA1基因表達(dá)的總體來看，我們推測：長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)健康大鼠骨骼肌線粒體代謝的擾動(dòng)也許并不顯著。低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的作用可能更多表現(xiàn)在對(duì)健康穩(wěn)態(tài)的維持，這在健康機(jī)體的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)方面與大強(qiáng)度、間歇性運(yùn)動(dòng)有明顯區(qū)別。相對(duì)而言，大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)Mfn2、OPA1的影響較劇烈，大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)使線粒體Mfn2蛋白上調(diào)（P < 0.05），但Mfn2 mRNA下調(diào)（P< 0.05），大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)使OPA1mRNA表達(dá)顯著高于耐力運(yùn)動(dòng)組（P < 0.05），但對(duì)Mfn1 mRNA卻無明顯影響。這提示：在等長訓(xùn)練周期中，線粒體融合基因與蛋白對(duì)兩種運(yùn)動(dòng)方式有差異性適應(yīng)機(jī)制，這種差異來源于運(yùn)動(dòng)方案的差異。我們推測Mfn1 mRNA表達(dá)對(duì)長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)可能較為敏感，Mfn2 mRNA與蛋白表達(dá)對(duì)大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)較敏感，不同運(yùn)動(dòng)方案可能激活不同的基因或蛋白信號(hào)。大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)增加線粒體Mfn2蛋白表達(dá)，可能增加了線粒體融合活性。由于Mfn2在代謝調(diào)節(jié)中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)推測，大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體代謝的影響可能比長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)還要大。但本實(shí)驗(yàn)尚不能對(duì)這些差異作更深入的機(jī)制性解釋。

線粒體分裂是調(diào)節(jié)線粒體空間形態(tài)的另一重要機(jī)制。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的研究表明，阻斷線粒體分裂導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰、ROS增加、蛋白質(zhì)氧化增加以及mtDNA丟失［18］，線粒體分裂還關(guān)聯(lián)著線粒體的功能調(diào)節(jié)［19］、細(xì)胞凋亡［20］與線粒體疾病的發(fā)生（神經(jīng)退行性疾病［21］與骨骼肌萎縮等［22］）。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的線粒體分裂由Drp1、hFisl介導(dǎo)。孫衛(wèi)東等研究表明，急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌hFisl mRNA表達(dá)明顯增加，運(yùn)動(dòng)后骨骼肌hFisl mRNA逐漸減少；運(yùn)動(dòng)后24 h未恢復(fù)到安靜水平，hFisl基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)是線粒體對(duì)細(xì)胞能量需求急增的一種快速應(yīng)答反應(yīng)［5］。本研究旨在觀察長期運(yùn)動(dòng)對(duì)hFis1基因表達(dá)的累積效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)和大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌hFisl mRNA表達(dá)均無顯著影響；由于hFis1基因表達(dá)的快速應(yīng)答特點(diǎn)，本研究認(rèn)為，hFisl mRNA表達(dá)對(duì)急性運(yùn)動(dòng)可能比較敏感，長期運(yùn)動(dòng)并未導(dǎo)致hFisl mRNA表達(dá)水平的適應(yīng)性改變。相對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)而言，Drp1受大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)的影響比較顯著。大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致Drp1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P< 0.05），但線粒體Drp1蛋白表達(dá)下調(diào)（P < 0.05），Drp1 mRNA及其蛋白表達(dá)均顯著區(qū)別于耐力運(yùn)動(dòng)組（P < 0.05），表明Drp1基因與蛋白對(duì)兩種運(yùn)動(dòng)方式有著顯著不同的適應(yīng)機(jī)制，這種差異依然來源于運(yùn)動(dòng)方案的差異。與Mfn1/2、OPA1和hFis1不同的是，Drp1蛋白結(jié)構(gòu)不含線粒體跨膜序列［3］。Drp1定位于胞漿，線粒體分裂時(shí)才被hFis1募集［23］，Drp1在線粒體組分中的蛋白水平可近似地反映hFis1對(duì)Drp1的募集程度，進(jìn)一步可反映線粒體的分裂活性。因此，Drp1蛋白下調(diào)的結(jié)果提示：大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)很可能抑制了線粒體的分裂活性，這與線粒體Mfn2蛋白上調(diào)可能協(xié)同促進(jìn)線粒體融合。長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)未見此效應(yīng)。

由于線粒體融合、分裂與代謝之間密切相關(guān)，我們推測，運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)影響很可能參與了線粒體的代謝調(diào)控。研究表明，線粒體融合分裂與骨骼肌胰島素敏感性、脂肪酸氧化、線粒體生物發(fā)生、代謝可塑性以及能量生成關(guān)系密切［24］。Mfn2介導(dǎo)線粒體融合的同時(shí)，也能調(diào)節(jié)氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)，促使線粒體膜電位形成［12］。Mfn2表達(dá)抑制不僅導(dǎo)致線粒體融合抑制，還導(dǎo)致脂肪合成速率下降、高脂血癥、胰島素抵抗［25］。鑒于Mfn2的重要代謝調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)極有意義的生理發(fā)現(xiàn)是，兩種運(yùn)動(dòng)方式誘導(dǎo)了不同的Mfn2表達(dá)變化，Mfn2在調(diào)節(jié)線粒體融合的同時(shí)，也可能控制著骨骼肌對(duì)兩種運(yùn)動(dòng)方式的不同代謝適應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)代謝性疾病的運(yùn)動(dòng)防控策略有一定指導(dǎo)意義。

4 總結(jié)

線粒體融合分裂基因以及線粒體Mfn2、Drp1蛋白，對(duì)長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)和大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)有不同的適應(yīng)機(jī)制，這種差異來源于運(yùn)動(dòng)方案的差異。大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)可能在Mfn2、Drp1基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)兩個(gè)水平顯著影響骨骼肌線粒體的融合分裂；而長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)僅對(duì)Mfn1基因轉(zhuǎn)錄有顯著上調(diào)作用。

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