實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測應(yīng)力性骨折新兵外周血TNFRSF10C mRNA表達(dá)

王毅錚 趙化冰 蘭曉霞 張明順 高宏生 張國輝 趙國平，4 尹光雅，4 王世鑫

1 武警醫(yī)學(xué)院天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津 300162） 2 武警醫(yī)學(xué)院部隊(duì)衛(wèi)生學(xué)教研室 3 武警醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室 4 河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 5 天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院

應(yīng)力性骨折（stress fracture，SF）亦稱疲勞性骨折（fatigue fracture），是體育運(yùn)動(dòng)和軍事訓(xùn)練中常見的損傷。SF的病理特點(diǎn)為骨損傷與修復(fù)同時(shí)進(jìn)行，SF發(fā)生后如得不到充分休息，骨折部位可能出現(xiàn)骨折－修復(fù)－再骨折－再修復(fù)的反復(fù)過程，導(dǎo)致骨折延遲愈合、不愈合，甚至局部骨壞死［1］。因此，早期診斷是防治SF的關(guān)鍵?，F(xiàn)有SF診斷方法多為臨床現(xiàn)場診斷與影像診斷相結(jié)合，主觀因素較大，常造成誤診；而SF診斷的金標(biāo)準(zhǔn)核骨掃描造價(jià)昂貴，使用有局限性。我們前期研究［2］采用人表達(dá)譜芯片技術(shù)，獲得SF患者外周血白細(xì)胞基因表達(dá)譜變化的研究數(shù)據(jù)。本研究旨在驗(yàn)證前期芯片結(jié)果可信性，并進(jìn)一步觀察TNFRSF10C基因差異表達(dá)與SF之間的關(guān)系，為分析SF病理機(jī)制提供mRNA水平的證據(jù)，同時(shí)也為初步探索TNFRSF10C基因作為SF早期診斷生物標(biāo)志物的可行性積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取自駐津武警某部2008年度入伍新兵（均為男性）。采用1:1配比的病例對照研究，正常對照組10例，應(yīng)力性骨折組10例。病例對照配比標(biāo)準(zhǔn)為：與病例處于相同連隊(duì)（訓(xùn)練量和科目相同），身體條件（BMI指數(shù)）相似，但未發(fā)生SF的戰(zhàn)士。SF診斷標(biāo)準(zhǔn)為［3］：①傷史采集：主訴四肢某部位無明顯原因的較為固定的疼痛，且疼痛隨訓(xùn)練強(qiáng)度加大而加重，休息后自覺減輕；②專科檢診：沿骨干長軸觸診有局部固定壓痛點(diǎn)或縱向叩擊痛，可伴不同程度軟組織腫脹；③特殊檢查：常規(guī)X線檢查證實(shí)有骨膜反應(yīng)、骨裂或骨折者。凡具上述①、②或①、③均可診斷為SF。

1.2 主要試劑和儀器

外周血RNA提取試劑盒TRIpure LS Reagent購自北京BioTeke公司；cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和DL2000 plus DNA marker均購自北京TransGen Biotech公司；EX Taq和引物均購自寶生物工程（大連）有限公司；StepOne型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國AB公司；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.3 總RNA抽提與cDNA合成

取每位SF戰(zhàn)士及其1:1配比正常對照戰(zhàn)士的空腹肘靜脈血5ml，肝素抗凝。外周血總RNA提取按TRIpure LS Reagent試劑盒操作指南進(jìn)行，2h之內(nèi)完成。在260 nm/280 nm波長下測定總RNA濃度和純度。取至少1μg外周血總RNA參照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：樣 品 RNA 1μg、Random Primer（N9）（0.1μg/μl）1μl、2×ES Reaction Mix 10μl、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1μl，補(bǔ)充DEPC處理過的水至體積20μl。上述成分混勻后置于PCR儀中，25℃孵育10 min，42℃孵育50 min，70℃15 min滅活。

1.4 引物設(shè)計(jì)

為了保證本實(shí)驗(yàn)TNFRSF10C引物的特異性，根據(jù)已發(fā)表的TNFRSF10C mRNA序列（Genebank序列號 gi：22547120），先將 TNFRSF10C mRNA與其家族內(nèi)其他同源性較高的成員進(jìn)行Blast比較，選定有較高特異性的區(qū)段作為靶序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。將TNFRSF10C mRNA的靶序列輸入Primer Premier 5.0軟件，綜合考慮引物長度、GC含量、Tm值、自由能、引物二聚體等因素，獲得一組評價(jià)較高的引物。該組引物分別與TNFRSF10C mRNA序列1140bp-1160bp以及1330bp-1350bp區(qū)段互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物長度均為21bp，GC含量均為52.38%，退火溫度分別為51.41℃和51.92℃。TNFRSF10C上游引物 ：5’CTGGCTCTATCTTCCTCCTTG 3’， 下 游 引物 ：5’CTTCTCATCCTCACCCTTGTC 3’， 擴(kuò) 增 片段長度為211bp。內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶（glyseraldenhyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因，上游引物：5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 3’，下游引物：5’AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴(kuò)增片段長度為258bp。GAPDH引物引自網(wǎng)上公布的通用引物（www.shinegene.org.cn）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

20μl反 應(yīng) 體 系 ：SYBRR?Premix Ex TaqTM（2×）10μl；PCR Forward Primer（10μM）1μl；PCR Reverse Primer（10μM）1μl；模板 cDNA 2μl；以去離子水補(bǔ)足20μl。TNFRSF10C基因反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10min，94℃ 50 s，50℃ 30 s，72℃25 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH擴(kuò)增條件退火溫度為56℃，其他與TNFRSF10C相同。為了避免引物二聚體干擾熒光信號，檢驗(yàn)擴(kuò)增目的片段的特異性，在每個(gè)循環(huán)內(nèi)加入讀板步驟，于82 ℃采集熒光信號，總延伸結(jié)束后，加入溶解曲線的制備（65～95℃，每0.2 ℃讀板一次）步驟。每個(gè)標(biāo)本均平行擴(kuò)增3管。

1.6 計(jì)算基因相對表達(dá)量

采用最優(yōu)反應(yīng)條件，完成10例SF病例及其對照樣本TNFRSF10C基因表達(dá)檢測。采用2－△△Ct法對TNFRSF10C基因表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析，GAPDH為管家基因。計(jì)算公式如下：△Ct（SF組）=SF組目的基因平均Ct值- SF組管家基因平均Ct值；△Ct（對照組）=對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值；△△Ct = △Ct（SF組）- △ Ct（對照組）；比率（SF組/對照組）= 2-△△Ct。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

經(jīng)Blast同源性檢索，所設(shè)計(jì)的目的基因引物只特異性結(jié)合人TNFRSF10C mRNA，未發(fā)現(xiàn)與人腫瘤壞死因子（TNF）超家族其他成員mRNA錯(cuò)配的報(bào)告。

2.2 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果

成功提取10例SF及其對照外周血RNA，260/280比值在1.5～1.9之間。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，擴(kuò)增每個(gè)樣本的GAPDH管家基因，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），各樣本均可擴(kuò)增出258 bp清晰條帶，各組樣本逆轉(zhuǎn)錄cDNA均符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件及特異性結(jié)果

TNFRSF10C基因及內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增效果及特異性見圖2。TNFRSF10C基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值在89.18 ℃，GAPDH基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值在86.63 ℃，每一循環(huán)內(nèi)選擇于82 ℃采集熒光信號，兩個(gè)基因擴(kuò)增均可排除引物二聚體的干擾。

2.4 TNFRSF10C基因相對表達(dá)量（SF/正常）結(jié)果

表1顯示，7例SF樣本的TNFRSF10C基因表達(dá)上調(diào)，3例下調(diào)。

表1 TNFRSF10C基因相對表達(dá)量real-time PCR檢測結(jié)果

3 討論

本課題組前期采用博奧公司晶芯系列雙通道人表達(dá)譜芯片，采用1:1配比病例對照研究，探討了SF發(fā)病期外周血基因表達(dá)譜的改變。在篩選到的22個(gè)SF差異表達(dá)基因中，TNFRSF10C基因表達(dá)差異最顯著，SF組比對照組上調(diào)3.96倍。TNFRSF10C基因是TNF受體超家族成員之一，該受體含有一個(gè)細(xì)胞外TRAIL結(jié)合區(qū)和一個(gè)跨膜區(qū)，兩者結(jié)合后共同發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TNFRSF10C基因表達(dá)與TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）表達(dá)密切相關(guān)［4］。大量文獻(xiàn)研究顯示，TRAIL是TNF配體家族的成員［5］，一方面TRAIL可以結(jié)合護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG），從而中和OPG具有的“減少骨吸收，增加骨密度”的骨保護(hù)作用［6-8］；另一方面TRAIL又是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞因子，高表達(dá)的TNFRSF10C對TRAIL進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示可能通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的數(shù)量，從而影響SF的發(fā)生發(fā)展。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了骨組織是一動(dòng)態(tài)組織，應(yīng)力作用于骨時(shí)，骨會(huì)發(fā)生適應(yīng)性的塑形改變，從而激活破骨過程（舊骨吸收）和成骨過程（新骨形成）。當(dāng)骨吸收過程超過骨形成過程，骨質(zhì)變得疏松，易于骨折［9］。因此，芯片結(jié)果提示我們TNFRSF10C基因表達(dá)上調(diào)可以作為SF發(fā)生的潛在預(yù)警信號。

為驗(yàn)證芯片結(jié)果的可信性，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測了10例SF病例及對照外周血的TNFRSF10C基因表達(dá)，結(jié)果顯示，10例樣本中有7例TNFRSF10C基因表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)從1.4倍至6.7倍。其中兩例差異較大，上調(diào)倍數(shù)（6.7、3.5）接近或超過芯片水平；兩例上調(diào)倍數(shù)（2.4、2.2）大于2；3例上調(diào)倍數(shù)小于2（1.4、1.6、1.8）。另有3例SF樣本TNFRSF10C基因表達(dá)分別下調(diào)50%、90%和90%。這表明SF組TNFRSF10C基因表達(dá)變化趨勢與芯片結(jié)果基本一致。本次選擇的SF病例為發(fā)病早期，癥狀較輕，這可能是造成3例樣本TNFRSF10C基因表達(dá)上調(diào)趨勢小于芯片結(jié)果的原因。另外，前期芯片實(shí)驗(yàn)的SF病例及對照均先與共同參照物比較，消除個(gè)體差異后才對差異基因進(jìn)行分析，故可能由于本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取的1:1配比病例對照個(gè)體差異較大，造成3例SF樣本TNFRSF10C基因表達(dá)下調(diào)。

SF是運(yùn)動(dòng)員及軍人職業(yè)訓(xùn)練中常見的運(yùn)動(dòng)損傷，早期診斷是預(yù)防的關(guān)鍵。因此，SF的生物標(biāo)志物研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但目前只有少數(shù)研究報(bào)道了某些SF血清生化標(biāo)志物［10，11］，我們前期的芯片實(shí)驗(yàn)篩選得到的差異表達(dá)基因TNFRSF10C為SF早期診斷提供了RNA水平的線索。本研究在此基礎(chǔ)上，建立了TNFRSF10C基因的實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法，并驗(yàn)證了10例SF病例及對照外周血TNFRSF10C基因表達(dá)差異情況。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討SF發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)早期診斷生物標(biāo)志物提供了方向，對運(yùn)動(dòng)員及戰(zhàn)士訓(xùn)練傷防治具有重要意義。下一步研究應(yīng)盡力克服取材困難，在較大樣本范圍內(nèi)對前期芯片結(jié)果予以驗(yàn)證。

［1］Warden SJ，Hurst JA，Sanders MS，et al. Bone adaptation to a mechanical loading program significantly increases skeletal fatigue resistance. J Bone Miner Res，2005，20（5）：809-816.

［2］趙化冰，王毅錚，蘭曉霞，等.基因芯片篩選應(yīng)力性骨折差異表達(dá)基因.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2010，28（11）：34-38

［3］吳在德，吳肇漢. 外科學(xué).第6版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2007. 860-861.

［4］Kimberley FC，Screaton GR. Following a TRAIL：update on a ligand and its five receptors. Cell Res，2004，14（5）：359-372.

［5］Pan G，Ni J，Wei YF，et al. An antagonist decoy receptor and death domain-containing receptor for TRAIL.Science，1997，277（5327）：815-818.

［6］Colucci S，Brunetti G，Cantatore FP，et a1.The death receptor DR5 is involved in TRAIL-mediated human osteoclast apoptosis. Apoptosis，2007，12（9）：1623-1632.

［7］Greil R，Anether G，Johrer K，et al.Tuning the rheostat of the myelopoietic system via Fas and TRAIL. Crit Rev Immunol，2003，23（4）：301-322.

［8］Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et a1. Osteoprotegerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell，1997，89（2）：309-319.

［9］Kiuru MJ，Pihlajamaki HK，Ahovuo JA. Bone stress injuries. Acta Radiol，2004，45（3）：317-326.

［10］陳耀明，齊宗利，吳端宗，等. 兔應(yīng)力性骨折形態(tài)學(xué)和肌勻漿磷脂酶A2活性的改變. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，200l，19（5）：328-331.

［11］劉朋，齊進(jìn)如，王崢春. 應(yīng)力性骨折與血清堿性磷酸酶關(guān)系及其診斷分析. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，10（5）：396-398.