苦參中總黃酮提取工藝研究

盧麗萍，杜慧琴，張 蕾＊，廖瓊峰，歐立娟

（1.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006；2.上海藥港生物技術有限公司，上海 201203）

苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait的干燥根。具有清熱燥濕，殺蟲，利尿的功效，主治熱痢，便血，黃膽尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風；外治滴蟲性陰道炎［1］。苦參主要含有生物堿和黃酮兩大類化學成分，目前，國內外對苦參的研究比較多，但大多集中在生物堿類成分，苦參黃酮類成分的研究較少，并且多集中在化學成分的分離分析和藥理作用上［2－6］，苦參總黃酮回流提取法的優化工藝尚未見文獻報道。本研究通過單因素循環和正交試驗考察了回流提取法各因素對總黃酮溶出率的影響，確定了適用于工業大生產的苦參總黃酮最優提取工藝，為合理開發和利用苦參資源提供了科學依據。

1 儀器與材料

UV－2100型紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司），GKC21CR4可控硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司），槐屬二氫黃酮 G對照品（自制，純度＞98.0%），其他試劑均為分析純?？鄥⑺幉馁徸詮V州致信藥業有限公司，由本院藥用植物學教研室周勁松老師鑒定。

2 方法與結果

2.1 苦參中總黃酮含量的測定［7］

2.1.1 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備。取槐屬二氫黃酮G對照品適量，精密稱定，用70%乙醇溶解并稀釋成每1mL含58μg槐屬二氫黃酮G的對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取苦參藥材粉末（40目）約0.4g，精密稱定，按單因素實驗和正交實驗中不同的提取條件進行回流提取，提取液經濾紙濾過至50mL量瓶中，80%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 顯色方法和測定波長

精密吸取供試品溶液、對照品溶液各1.0mL，置加有鎂粉300mg的具塞刻度試管中。將試管置冷水?。?5℃左右）中，緩慢滴加濃鹽酸3mL，并不時振搖試管。加70%乙醇補足至10mL，搖勻，置沸水浴中加熱60min，迅速冷卻至室溫，補足體積至10mL。在200～600nm范圍內掃描吸收光譜，確定測定苦參總黃酮的檢測波長為478nm。

2.1.3 標準曲線的繪制

精密吸取槐屬二氫黃酮G對照品溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0、5.0mL分別置6個加有鎂粉300mg的具塞刻度試管中。按鹽酸－鎂粉法顯色后，在478nm處測定吸光度。以對照品吸光度（Ai）為縱坐標，質量濃度（Ci）為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，槐屬二氫黃酮G在5.8～29.0μg／mL范圍內與吸光度呈良好線性關系，回歸方程為：A＝0.0262C－0.0049（n＝5，r＝0.9998）。

2.1.4 總黃酮含量的測定

精密吸取供試品溶液1.0mL，按“2.1.3”項下操作的方法測定吸光度，按外標一點法計算總黃酮含量。

2.2 苦參總黃酮提取工藝優化

2.2.1 單因素循環試驗

（1）乙醇體積分數的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，分別于80℃水浴中，用10倍量30%，50%，70%，95%乙醇回流提取1.5h（×1次），按上述“2.1”項下方法測定總黃酮的含量。乙醇體積分數對提取的影響如圖1所示，結果表明，70%～95%乙醇體積分數的提取效果較好。

（2）提取溫度的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，分別于60℃、70℃、80℃、90℃水浴中用20倍量70%乙醇回流提取1.5h（×1次），按上述2.1方法測定總黃酮的量。結果如圖1所示，水浴溫度80℃有利于苦參總黃酮的提取。

（3）提取時間的考察。取苦參藥材粉末（40目）5份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，用20倍量70%乙醇回流提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h 、3.0h（×1次），按上述“2.1”項方法測定總黃酮的量。結果如圖1所示，提取時間為1.0h時總黃酮的浸出量最高，再隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出量略微下降。

（4）提取料液比的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，分別用10倍量、20倍量、30倍量、40倍量70%乙醇回流提1.0h（×1次），按上述“2.1”方法測定總黃酮的量。結果如圖1所示，料液比1∶10～1∶40之間對總黃酮浸出率無明顯差異，最終選擇工業生產常用料液比1∶20。

（5）提取次數的考察。取苦參藥材粉末（40目）3份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，用20倍量70%乙醇分別回流提取1次、2次、3次，每次提取1.0h，按上述“2.1”項方法測定總黃酮的量。結果如圖1所示，料液比提取次數對總黃酮浸出率無明顯差異。

2.2.2 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，在80℃水浴中，用20倍量提取溶劑，以苦參中總黃酮含量作為評價指標。設計如表1所示的因素水平進行正交試驗，結果見表2和表3。

圖1 總黃酮單因素水平試驗結果

表1 因素水平

表2 正交試驗結果 （n＝3）

表3 方差分析結果

由表2可見各因素對苦參總黃酮含量的影響為A≈B＞C，最佳水平組合為A2B2C1。由表3的方差分析結果可見A和B因素的影響有顯著性意義，C因素則無顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結果，兼顧考慮縮短生產周期、減少能耗等因素，以A2B2C1為最佳提取工藝，即：用20倍量80%乙醇，80℃水浴中加熱回流提取1次，提取時間為1h。

2.2.3 最佳工藝的驗證

根據上述試驗得出的最佳工藝條件：乙醇濃度80%，提取溫度80℃，料液比1∶20，提取時間1.0h，提取次數1次。對其進行驗證，平行進行5樣本分析，測定苦參中總黃酮的含量（2.01±0.13）%。

3 討論

本試驗對苦參總黃酮回流提取工藝進行了系統的優化，發現乙醇體積分數、提取時間和提取溫度為影響其提取率的主要因素，而提取次數和溶劑倍數無顯著性影響。因而建議工業生產和植物化學研究領域，對于苦參的提取可以摒棄經驗提取習慣（2h×2次）。本文優化結果證明，以20倍量80%乙醇為提取溶劑，80℃控溫環境下，提取1h，僅需1次黃酮已基本提取完全。

本試驗選用正交實驗法優化苦參總黃酮回流提取工藝的實驗條件，大大提高了總黃酮的提取效率，為苦參中黃酮類化合物的深入研究和苦參藥用成分的進一步開發利用提供了科學依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：188－189.

［2］趙平，張穎君，山本浩文，等.苦參異戊烯基黃酮類化合物的化學活性及其生物合成研究進展 ［J］.天然產物研究與開發，2004，26（2）：172－178.

［3］趙慧娟，孫文基.苦參中黃酮類化合物的化學成分及藥理研究進展［J］.中藥材，2005，28（3）：247－251.

［4］劉鵬飛，程愛卿，鄧天昇，等.苦參中總黃酮含量的測定及分布研究［J］.中成藥，2007，29（4）：596－598.

［5］劉斌，石任兵，周素蓉.苦參湯有效部位總黃酮含量測定方法研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2004，10（6）：24－26.

［6］張瑞菊，張國英，孫海波，等.微波輔助提取苦參總黃酮［J］.食品研究與開發，2007，28（9）：43－46.

［7］盧麗萍，張蕾，廖瓊峰，等.苦參中總黃酮含量測定方法的研究［J］.今日藥學，2011，21（3）：146－148.