補充谷氨酰胺對過度訓練大鼠腹膜巨噬細胞IGF-1和MGF基因表達的影響

肖衛華 陳佩杰

1 上海體育學院運動科學學院（上海 200438）

2 湘南學院體育系

巨噬細胞是重要的非特異性免疫細胞，具有趨化、吞噬、殺菌、分泌炎性因子和抗原遞呈等多種功能，廣泛分布于肝臟、腎臟、肌肉、肺、腹腔和血液等多個組織器官，在機體病菌防御、炎癥反應、壞死組織清除和抑制腫瘤等方面具有重要作用[1]。胰島素樣生長因子（IGF-1）可介導生長激素的功能，具有促進蛋白合成、促進細胞增殖等多種功能[2]。研究表明，巨噬細胞可表達IGF-1[3]，且巨噬細胞來源的IGF-1在動脈粥樣硬化斑塊發展[3，4]、機體炎癥反應[5]、肺纖維化[6]、防止肌肉萎縮及促進損傷肌肉的修復[7]等過程中均有重要作用。

IGF-1前體可選擇性剪接產生多種異構體，如IGF-1Ea、IGF-1Eb等[8]，IGF-1Ea即為可由機體多個組織器官產生、已被廣泛研究的IGF-1。嚙齒目動物的IGF-1Eb相比IGF-1Ea插入了52個堿基對的一段序列，導致其羧基端有別于IGF-1Ea，功能和信號途徑均不同于 IGF-1Ea[9]，IGF-1Eb 被認為只能在機械應力敏感組織如肌肉中才可檢測到，所以又被稱為機械生長因子（mechano growth factor，MGF）[8]。MGF 具有不同于 IGF-1 的多種功能，具有激活肌衛星細胞，防止肌肉萎縮，促進肌肉體積增大和力量增加等多種功能[10，11]。MGF已是當前研究的熱點之一[12-14]。現有研究多集中于肌肉，對其他組織或細胞MGF的探討較少。巨噬細胞能表達IGF-1，但其能否表達MGF國內外尚未見報道。運動特別是過度訓練作為一種強烈應激，是否對巨噬細胞IGF-1和MGF表達產生影響，過度訓練時補充巨噬細胞必需的能量物質谷氨酰胺是否影響其IGF-1和MGF表達，均無相關資料。故本研究通過觀察過度訓練及補充谷氨酰胺對大鼠巨噬細胞IGF-1、MGF基因表達的影響，為IGF-1和MGF研究開拓新視野。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重180± 10 g，購于中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2007-0005]。動物飼養環境溫度為22 ± 2℃，相對濕度50%～70%，每日光照時間12 h，自由飲食。將大鼠隨機分為安靜對照組（C）、過度訓練組（E）、過度訓練補充谷氨酰胺組（EG）。后兩組根據取材時間不同再分為2組：運動后36 h取材組（E1、EG1）和運動后7天取材組（E2、EG2）。總計5組，每組8只。

1.2 運動方案及谷氨酰胺補充方案

動物適應性飼養1周后，E組、EG組開始進行遞增負荷跑臺訓練，每周訓練6次，周日休息，共11周。運動方案參照文獻的方法[15]（表1）。EG組L-谷氨酰胺（Sigma，產品編號G-3126）補充方案參考金其貫[16]方法并稍作修改，前4周逐周增加運動量至目標運動量，期間不補充谷氨酰胺，第5至8周灌胃（0.8 g/kg/d），以后幾周加至飲用水補充，劑量逐周加大到1.1 g/kg/d。

表1 運動方案

1.3 腹膜巨噬細胞分離與純化

最后1次訓練后36 h或7天后，斷頭處死大鼠，腹腔注射12 ml RPMI1640培養液（GIBCO公司），腹部按摩2分鐘后靜置5分鐘，在腹部作一長約2 cm切口并小心吸取腹腔灌洗液入離心管。離心去上清，0.1 M PBS洗兩遍后用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的RPMI1640培養液重懸細胞并移入6孔板，于37℃、含5%CO2的培養箱中貼壁培養2 h，傾去不貼壁細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞[17]，PBS輕柔洗滌2次，加入PBS小心吹打細胞入離心管，離心去上清收集細胞。

1.4 RNA抽提與cDNA合成

使用異硫氫酸胍－氯仿經典法抽提總RNA，主要試劑Trizol購自invitrogen公司。按Fermentas公司第一鏈cDNA合成試劑盒（K1621）說明，在0.2 ml eppendorf管中進行反轉錄，反應條件為：65℃，5 min；4℃，2 min；25℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。反應總體積20 μl，合成的cDNA儲存于-20℃備用。

1.5 熒光定量PCR

設計目的基因和內參基因熒光定量引物（表2），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。使用Rotor-Gene 3000定量PCR儀（Corbett Reseach）進行雙標曲法相對定量PCR（SYBR Green試劑盒購自Fermentas公司）。標準曲線的構建：取PCR產物稀釋一定倍數做標準曲線最高濃度點（105units），依次10倍梯度稀釋，共6個濃度。MGF基因在1～105units范圍內，檢測閾值（CT）與拷貝數對數呈線性關系，兩者相關系數r >0.99（圖1）。樣品中目的基因和內參基因CT值可通過各自標準曲線計算出相應濃度，二者比值即為該目的基因相對表達量，最后結果以處理組某基因表達量相對對照組變化倍數表示。此外，熔解曲線分析顯示MGF呈單一產物峰。IGF-1資料相同。

表2 熒光定量PCR引物

圖1 MGF標準曲線

1.6 統計學分析

實驗數據用SPSS17.0統計軟件處理，采用單因素方差分析，統計學水平定為0.05。

2 結果

表3顯示，安靜狀態下巨噬細胞即可表達IGF-1和MGF。11周過度訓練后36 h，巨噬細胞IGF-1、MGF表達量顯著增加，分別約為安靜對照組的21倍和92倍（P < 0.01）。EG1組IGF-1、MGF表達顯著增加，分別約為安靜對照的10倍和37倍（P < 0.01），但顯著低于E1組（P < 0.01）。停訓后恢復7天，E2組、EG2組IGF-1、MGF表達量分別與E1組、EG1組相比均顯著降低（P <0.01），但與C組相比差異無統計學意義（P > 0.05）。

表3 各組IGF-1、MGF基因表達（相對C組變化倍數）

3 討論

本研究發現，安靜狀態下巨噬細胞內IGF-1和MGF均有表達。11周過度訓練后，巨噬細胞IGF-1和MGF mRNA表達顯著增加，與安靜組相比分別增加了約21倍和92倍。巨噬細胞MGF表達相比IGF-1對運動應激更敏感，這與肌肉MGF表達水平對訓練更敏感的報道一致[18]。運動后恢復期，IGF-1和MGF表達仍處于較高水平，但與安靜對照組相比無顯著性差異。因IGF-1和MGF有多種功能，因此，過度訓練狀態下巨噬細胞產生大量IGF-1和MGF可能參與機體多種生理過程。但巨噬細胞IGF-1和MGF過度活化對巨噬細胞產生何影響，相關資料較少。有報道顯示，IGF-1有促進巨噬細胞分泌TNF-α[19]和IL-1β[20]等炎性因子，促進巨噬細胞攝取和降解低密度脂蛋白[21]，誘導巨噬細胞向炎癥部位遷移參與炎癥反應[3]，調控巨噬細胞的分化和存活[22]等多種功能。而國內外尚無MGF是否對巨噬細胞功能產生影響的研究。本課題組通過離體實驗（另文發表）發現，不同濃度的重組IGF-1對巨噬細胞吞噬功能、活性氧生成無明顯影響；而MGF呈濃度依賴性地抑制巨噬細胞的吞噬功能，較低濃度MGF對巨噬細胞胞內活性氧（ROS）生成產生明顯的抑制作用。吞噬功能是巨噬細胞抵御病原入侵最重要的功能之一，生理濃度的ROS是巨噬細胞發揮其正常功能的基礎[23-25]，因此，MGF對巨噬細胞吞噬和ROS產生明顯抑制效應表明，MGF是巨噬細胞的負向調控因子。本研究中，過度訓練使巨噬細胞通過自分泌形式產生大量MGF，抑制巨噬細胞功能，這可能是過度訓練造成免疫抑制的機制之一。此外，本研究發現，補充谷氨酰胺可部分抑制巨噬細胞IGF-1和MGF對過度訓練的應答，顯著降低過度訓練后巨噬細胞IGF-1和MGF增加幅度。這對巨噬細胞可能具有重要意義：即減輕MGF過度激活對巨噬細胞功能的不利影響，利于巨噬細胞維持正常功能。總之，本研究結果首次證明了巨噬細胞可表達MGF，且在過度訓練時急劇增加，這將為MGF研究開啟一個全新的視角：即巨噬細胞來源的MGF可能在機體多種生理活動中發揮重要作用。

4 總結

靜息態巨噬細胞可表達IGF-1和MGF。過度訓練可顯著增強巨噬細胞IGF-1和MGF表達，且MGF表達對運動應激更敏感。補充谷氨酰胺可部分抑制巨噬細胞IGF-1和MGF對過度訓練的應答。

[1]Murphy EA，Davis JM，Brown AS，et al. Role of lung macrophages on susceptibility to respiratory infection following short-term moderate exercise training. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287（6）：R1354-R1358.

[2]Adams GR. Role of insulin-like growth factor-I in the regulation of skeletal muscle adaptation to increased loading. Exerc Sport Sci Rev，1998，26（1）：31-60.

[3]Furundzija V，Fritzsche J，Kaufmann J，et al. IGF-1 increases macrophage motility via PKC/p38-dependent αvβ3-integrin inside-out signaling. Biochem Biophys Res Commun，2010，394（3）：786-791.

[4]Okura Y，Brink M，Zahid AA，et al. Decreased expression of insulin-like growth factor-1 and apoptosis of vascular smooth muscle cells in human atherosclerotic plaque. J Mol Cell Cardiol，2001，33（10）：1777-1789.

[5]Summan M，Warren GL，Mercer RR，et al. Macrophages and skeletal muscle regeneration：a clodronatecontaining liposome depletion study. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，290（ 6）：R1488-R1495.

[6]Cao B，Guo Z，Zhu Y，et al. The potential role of PDGF，IGF-1，TGF-beta expression in idiopathic pulmonary fibrosis. Chin Med J（Engl），2000，113（9）：776-782.

[7]DumontN，Frenette J.Macrophages protect against muscle atrophy and promote muscle recovery in vivo and in vitro： a mechanism partly dependent on the insulin-like growth factor-1 signaling molecule. Am J Pathol，2010，176（5）：2228-2235.

[8]Iida K，Itoh E，Kim DS，et al. Muscle mechano growth factor is preferentially induced by growth hormone in growth hormone-de ficient lit/lit mice. J Physiol，2004，560（2）：341-349.

[9]Yang SY，Goldspink G. Diffrent roles of the IGF-I Ec peptide（MGF） and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation. FEBS Letters，2002，522（1）：156-160.

[10]Barton-Davies ER，Shortuma DI，Musaro A，et al.Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15603-15607.

[11]Goldspink G. Impairment of IGF-I gene splicing and MGF expression associated with muscle wasting. Biochem Biol，2006，38（3）：481-489.

[12]史仍飛，卞玉華，危小焰. 振動訓練對大鼠骨骼肌質量和肌細胞機械生長因子mRNA表達的影響. 中國運動醫學雜志，2008，27（4）：508-510.

[13]肖衛華，陸耀飛. 骨骼肌損傷后修復過程中機械生長因子作用研究. 體育科學，2008，28（6）：34-38.

[14]肖衛華，陸耀飛. 機械生長因子實時熒光定量RT-PCR檢測方法研究. 上海體育學院學報，2010，34（6）：43-45.

[15]HohlR，Ferraresso RL，DE Oliveira RB，et al. Development and characterization of an overtraining animal model. Med Sci Sports Exerc，2009，41（5）：1155-1163.

[16]金其貫. 谷氨酰胺和精氨酸對運動性免疫抑制干預作用的研究. 北京體育大學博士學位論文，2003. 45.

[17]黃勝，陽曉，李曉艷，等. 高糖對腹膜巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶的作用. 中國病理生理雜志，2008，24（3）：588-590.

[18]Hameed M，Orrell RW，Cobbold M，et al. Expression of IGF-I splice variants in young and old human skeletal muscle after high resistance exercise. J Physiol，2003，547（1）：247-254.

[19]RenierG，Clément I，Desfaits AC，et al. Direct stimulatory effect of insulin-like growth factor-I on monocyte and macrophage tumor necrosis factor-alpha production.Endocrinology，1996，137（11）：4611-4618.

[20]Ueland T，Fougner SL，Godang K，et al. Associations between body composition，circulating interleukin-1 receptor antagonist，osteocalcin，and insulin metabolism in active acromegaly. J Clin Endocrinol Metab，2010，95（1）：361-368.

[21]Hochberg Z，Hertz P，Maor G，et al. Growth hormone and insulin-like growth factor I increase macrophage uptake and degradation of low-density lipoprotein. Endocrinology，1992，131（1）：430-435.

[22]Oberlin D，Fellbaum C，Eppler E. Insulin-like growth factor I messenger RNA and protein are expressed in the human lymph node and distinctly con fined to subtypes of macrophages，antigen-presenting cells，lymphocytes and endothelial cells. Immunology，2009，128（3）：342-350.

[23]Wang Y，Zeigler MM，Lam GK，et al. The role of the NADPH oxidase complex，p38 MAPK，and Akt in regulating human monocyte/macrophage survival. Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36（1）：68-77.

[24]Lee NK，Choi YG，Baik JY，et al. A crucial role for reactive oxygen species in RANKL-induced osteoclast differentiation. Blood，2005，106（3）：852-859.

[25]Roy KR，Arunasree KM，Dhoot A，et al. C-Phycocyanin inhibits 2-acetylaminofluorene-induced expression of MDR1 in mouse macrophage cells： ROS mediated pathway determined via combination of experimental and in silico analysis. Arch Biochem Biophys，2007，459（2）：169-177.