陣列型微拓撲結構基底的制備及其對神經細胞電生物物理特性的影響*

吳澤志 ，朱滿根，Kisaalita W S，Wang L，Zhao Y P，林 雨，黃豈平，廖彥劍，Li C Z

1．教育部生物流變科學與技術重點實驗室，重慶大學生物工程學院，重慶400044;2．佐治亞大學工程部細胞生物工程實驗室，美國雅典佐治亞30602;3．佐治亞大學物理學及天文學系，美國 雅典佐治亞30602; 4．佛羅里達國際大學生物醫學工程系納米生物工程/生物電子實驗室，邁阿密佛羅里達33174

早在上世紀初，Harrison以蜘蛛網進行的細胞培養實驗就發現基底的拓撲結構會影響細胞的取向、遷移和細胞骨架結構[1]。六十年代以來，細胞對基底拓撲結構的響應，如接觸誘導，被證實并受到研究者的高度重視[2]。在細胞培養的實踐中，增加培養皿的表面納米粗糙度從而促進細胞的粘附與生長已經為人們所接受。九十年代以來，隨著微納米加工技術的成熟，細胞與材料表面或培養基底拓撲結構相互作用的研究有了更加深入全面的發展。研究發現，基底拓撲結構與細胞的粘附及形態鋪展、排列取向、增殖及凋亡、胞外基質分泌以及干細胞定向與分化等眾多生物學行為的調控密切相關[3－5]。

盡管拓撲結構的效應涉及復雜的細胞生物學行為的調控，細胞的粘附及由此導致的形態鋪展卻是最受關注和被廣泛研究的現象。Bettinger等[3]認為在基底拓撲結構條件下的細胞形態學響應不僅是細胞與拓撲結構表面相互作用的指標，也是進一步二級效應的基礎，如細胞在拓撲結構表面的鋪展和牽張反應[6]引起細胞膜機械敏感離子通道的開啟、離子跨膜運動、細胞膜生物物理特性的改變[4－5]以及由此啟動的胞內信號機制[7]。

在細胞生物傳感器的研究中，拓撲結構微環境的構建涉及傳感器細胞表型的控制、功能響應性的優化[8－9]以及傳感器細胞與記錄結構的對接[10－11]。對于以神經細胞為基礎的細胞生物傳感器，細胞離子通道功能的表達、膜電位的建立是細胞最重要的功能特性。電壓依從式鈣離子通道VGCCs(Voltage-Gated Calcium Channels，是與多種神經及心血管系統疾病有關的離子通道和重要的藥物篩選靶標[12]。前期的研究顯示，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y在高縱橫比拓撲結構條件下細胞鋪展程度降低乃至形成三維細胞聚集，靜息膜電位更負，VGCCs功能響應性降低[13－15]。這一結果提示，采用適當設計的拓撲結構基底培養細胞有可能促進細胞的鋪展，引導細胞維持低負的靜息膜電位和增強VGCCs的功能響應性。

為評價微米級拓撲結構對神經細胞粘附、鋪展、靜息膜電位建立以及VGCCs功能響應性的影響，本文以紫外光光刻、硅蝕刻及軟光刻技術制備了微柱陣列型拓撲結構基底。作者發現特征尺寸為2 μm的拓撲結構基底已經接近實驗條件下該法的極限加工能力。采用一種簡單的傾斜角法可以制備一種聚苯乙烯微球致密陣列型拓撲結構細胞培養基底。該微球致密陣列基底的微球直徑可以小至2 μm或submicro。以H945RB．3人神經干細胞進行實驗發現，拓撲結構基底能促進神經細胞的粘附與鋪展，引導細胞維持低負的靜息電位水平，增強細胞VGCCs的功能響應。

1 實驗

1．1 微柱陣列型拓撲結構的加工

采用紫外光光刻、硅蝕刻及軟光刻技術制備微柱陣列型拓撲結構細胞培養基底。石英鉻掩模由中國科學院微電子所制版加工。實驗設計了圓形和方形兩種微柱陣列，其特征尺寸(直徑或邊長)分別為1 μm、2 μm、4 μm 和10 μm，結構間距分別為2 μm、4 μm 和7 μm，結構高度為4 μm。紫外光光刻及硅主模的加工由中國電子科技集團二十四所協作完成。主模采用P＜100＞硅片(電阻率7～13，北京有研)進行加工。其基本步驟包括:①氧化，②負性光刻膠涂層，③光刻顯影，④氫氟酸濕法二氧化硅薄層蝕刻，⑤BOSCH工藝干法蝕刻及光刻膠的去除。PDMS微拓撲結構制備方法為:將聚二甲基硅氧烷[poly(dimethylsiloxane)，PDMS]預聚體與固化劑按10∶1的比例混合均勻澆注于硅主模上，抽氣真空30 min，50℃下固化2 h，將固化的PDMS剝離即得到PDMS微拓撲結構基底。

1．2 聚苯乙烯微球致密陣列拓撲結構的加工

聚苯乙烯微球致密陣列拓撲結構的加工采用直徑為25 mm的圓形蓋玻片為支撐基底。蓋玻片經旋轉涂層制備約0．1 μm 厚的聚苯乙烯襯底[13]。所用聚苯乙烯微球平均直徑為 0．51 μm(Cat．Code PS03N，Bangs Laboratories，Inc．，美國)和 1．98 ± 0．20 μm(Cat．Code PS04N，Bangs Laboratories，Inc．，美國)。微球用蒸餾水稀釋為濃度約1．7%的懸液。將約30μL微球懸液放置于經聚苯乙烯涂層的蓋玻片表面。蓋玻片傾斜約10°，靜置30 min以上后可見大片微球致密陣列形成[16]。為穩定聚苯乙烯微球與涂層表面的粘結，將上述微球致密陣列于104℃烘箱中焙干35 min。聚苯乙烯平面基底及微球致密陣列經等離子氧蝕刻150 s以增加表面粗糙度。蝕刻前后聚苯乙烯平面基底的納米粗糙度采用原子力顯微鏡(AFM)(AUTOPROBE CP Research，TM Microscopes，美國)非接觸模式測量。

1．3 神經干細胞的培養

H945RB．3 人神經干細胞[17]購自美國 Millipore公司(ENStem-ATM)。細胞培養皿/拓撲結構基底(微球致密陣列)先后經40 μg/mL的多聚鳥氨酸(Sigma，美國)及5 μg/mL的鼠基底膜層粘連蛋白分別裱襯至少2 h。神經干細胞于35 mm培養皿中進行擴增。擴增培養液由Neurobasal基礎培養基(Invitrogen，美國)添加2 mmol/L L－谷氨酰胺、20 ng/mL bFGF(Sigma，美國)、10 ng/mL 白血病抑制因子(LIF，Chemicon，美國)和2%B －27 添加劑(Invitrogen，美國)。細胞隔日換液。在細胞融合度達到90～100%時，以機械法制成細胞懸液。將約1．2×106細胞接種于新的培養皿。對于分化實驗，制備微球致密陣列或裱襯聚苯乙烯的平面基底被放置于35 mm的培養皿中。在細胞接種后2 d(分化后第0 d)，培養液被換成分化培養液。分化培養液與擴增培養液組成成分相同，但分化培養液未添加bFGF。在分化后第0 d、6 d、7 d、11 d 和13 d 進行全換液，在分化后第2 d、4 d和9 d進行半換液。細胞形態及生長行為以Nikon ECLIPSE TE300倒置顯微鏡進行觀察并以Nikon D100數碼相機進行顯微攝像。

1．4 掃描電子顯微觀察

PDMS拓撲結構基底經制作完成后，放于烘箱中干燥24 h。樣本經離子濺射儀(KYKY SBC－12)濺射涂膜鍍金60 s(相當于鍍金厚度15．3 nm)。電鏡照片的拍攝采用掃描電鏡(Tescan VEGA-IILMU Scanning Electron Microscopes，捷克)，加速電壓設置為10．00 kV。

在細胞分化的第7 d和14 d，培養于微球致密陣列或聚苯乙烯平面基底的神經干細胞經含2%戊二醛的0．1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7．2)固定1 h后，用二甲胂酸鈉緩沖液(不含戊二醛)沖洗三次，每次15 min。樣本進一步用含1%OsO4的二甲胂酸鈉緩沖液固定1 h，以二甲胂酸鈉緩沖液清洗3次，每次5 min。分別使用30%、50%、70%、80%、95%和100%的乙醇進行梯度脫水，每步10 min。經臨界點干燥儀(SAMDRI－780A，Tousimis Research Corporation，美國)進一步干燥后，樣本被濺射涂膜鍍金90 s(相當于鍍金厚度23 nm)。掃描電鏡照片的拍攝采用LEO 982或Zeiss 1450EP掃描電子顯微鏡進行，加速電壓設置為5 kV。掃描電鏡圖片中細胞形態學測量采用 Simple PCI圖像軟件(Compix Inc．，美國)進行。測量時包繞細胞體、片足和神經突起，測量細胞投影面積和周長，計算細胞圓度。圓度定義為4×π×投影面積/(周長)2。

1．5 細胞靜息膜電位的測量

靜息膜電位以電勢熒光染料四甲基羅丹明甲酯(TMRM，Molecular Probes，美國)結合激光共聚焦顯微技術進行測量。細胞以無酚紅Neurobasal基礎培養基清洗2次，以含500 nmol/L TMRM的無酚紅Neurobasal基礎培養基清洗2次。細胞以500 nmol/L TMRM在含2%B－27添加劑的無酚紅Neurobasal基礎培養基平衡40 min。樣本采用Nikon PCM－2000激光共聚焦系統以543 nm綠色氦氖激光進行掃描。該系統連接Nikon ECLIPSE TE300倒置顯微鏡并配置60×復消色差高數值孔徑(1．4)油鏡。

由于TMRM于平衡時在細胞膜內外呈Nernstian分布，細胞靜息膜電位值可以通過膜內外的熒光強度比值計算[18－19]。由于 H945RB．3 神經干細胞對纈氨霉素處理高度敏感，本部分研究未采用先前校正非特異性染料分布量的方法[13－14，19]。采用如下公式計算細胞的靜息電位值:

其中，Fin和Fout分別為細胞內外的熒光強度值，B為背景熒光強度值。測量在細胞內外定義的感興趣區域進行ROI(Regions of Interest)。熒光強度以ROIs內的平均灰度讀數值表示。

1．6 VGCCs功能響應性的評價

VGCCs功能響應性的評價采用在50 mmol/L高鉀溶液刺激下細胞鈣離子內流的動態反應來評價。在神經干細胞分化的第0 d、7 d和14 d，微球致密陣列或聚苯乙烯平面基底上的細胞經無酚紅Neurobasal基礎培養基清洗2次，在添加了2%B－27添加劑和 0．02% Pluronic F－127(Molecular Probes，美國)的無酚紅Neurobasal基礎培養基中以5 μmol/L Calcium Green－1 AM于37℃二氧化碳孵箱中染色1 h。細胞經清洗后于添加了2%B－27添加劑、3%熱滅活胎牛血清和0．02%Pluronic F－127的無酚紅Neurobasal基礎培養基中在37℃二氧化碳孵箱再孵育45 min進行染料去酯化。以488 nm氬激光掃描，以515 nm長通濾片采集激光共聚焦圖像。圖像采集速率為每3 s 1幅。在圖像采集過程中于細胞孵育液中加入含500 mmol/L K+的無酚紅Neurobasal基礎培養基使孵育液K+終濃度為50 mmol/L。VGCCs功能響應性表現為在高鉀去極化作用下細胞內鈣離子濃度增高以及由此導致的細胞內Calcium Green－1熒光強度增加。以Calcium Green－1熒光強度對時間作圖，求得高鉀刺激后Calcium Green－1熒光強度相對于刺激前熒光強度的相對增加幅度為VGCCs的相對響應幅度。

1．7 數據處理及統計分析

形態學參數、細胞內外熒光強度比、靜息電位值以及VGCCs相對響應幅度以M±SD(算術平均值±標準偏差)表示。采用兩樣本均數的t檢驗進行平面基底及拓撲結構基底條件下以及不同分化或培養天數時細胞形態學參數、靜息電位值以及VGCCs相對響應幅度之間的比較。以P＜0．05作為統計學差異顯著性的判斷標準。

2 結果

圖1 PDMS圓形微柱陣列型拓撲結構基底的掃描電子顯微照片

2．1 微柱陣列型拓撲結構的制備

圖1示PDMS圓柱陣列型拓撲結構基底的掃描電鏡照片。圖中圓柱名義直徑分別為2 μm(a和b)、4 μm(c和d)以及10 μm(e和 f)。圓柱名義間距分別為2 μm(a、c 和 e)和 4 μm(b、d 和 f)。從圖中可見，在實驗條件下使用紫外光光刻、硅蝕刻及軟光刻技術能夠制備結構清晰的圓柱陣列。但在圓柱直徑為2 μm時，由于高度為4 μm而結構縱橫比達到2，出現結構的倒伏。實驗條件下同時制備了方形微柱陣列并發現，實驗條件下在特征尺寸(邊長)為2 μm時出現結構的缺失;當特征尺寸達4 μm或以上時，可以加工出結構規整清晰的微柱陣列(未顯示結果)。

2．2 聚苯乙烯微球致密陣列拓撲結構的加工

圖2示以0．51 μm聚苯乙烯微球制備的微球致密陣列在等離子氧蝕刻前及蝕刻后的掃描電鏡照片。從圖中可見，該拓撲結構基底呈規則二維六角陣列。等離子氧蝕刻后，微球間距加大，微球表面變得粗糙。以AFM在1 μm×1 μm的掃描范圍內測量發現，平面聚苯乙烯基底在等離子氧蝕刻后均方根粗糙度從0.1890 nm 增加至0．3401 nm。以1．98 μm 的微球可以得到同樣的規則六角致密陣列(見§2．3)。

圖2 以0．51 μm聚苯乙烯微球制備的微球致密陣列

2．3 微球致密陣列拓撲結構對神經干細胞形態鋪展的影響

圖3示H945RB．3神經干細胞培養于聚苯乙烯平面基底和1．98 μm微球致密陣列上的相差顯微照片。由于微球致密陣列在相差顯微鏡下透明性差，呈灰暗區域，在陣列上生長的細胞易被忽略。細胞在平面基底和微球陣列上呈類似的生長密度。分化實驗在細胞融合度達60%時開始進行(a和b)。在分化第1周內細胞逐漸停止增殖。在分化第7 d時細胞胞體較之分化前明顯變小，出現神經突起(c和d)。在分化第14 d，神經突起形成更長、更明顯(e和f)。

圖3 H945RB．3神經干細胞培養于聚苯乙烯平面基底和1．98 μm微球致密陣列上的相差顯微照片

圖4為HB945RB．3人神經干細胞于分化前(a和b)及分化第14 d(c和d)在聚苯乙烯平面基底(a和c)以及1．98 μm微球致密陣列拓撲結構基底(b和d)的掃描電鏡照片。從圖中可見，在分化開始前(分化第0 d)，細胞在平面基底和微球陣列均呈良好的粘附與鋪展(a和b)。在分化的第14 d，細胞在平面基底上呈弱的粘附與鋪展，電鏡制樣使得多數細胞出現剝離現象(c)。與此相反，細胞在微球陣列上仍呈良好的粘附與鋪展狀態(d)。

圖4 HB945RB．3人神經干細胞在聚苯乙烯平面基底(a和c)以及1．98 μm微球致密陣列拓撲結構基底(b和d)上的掃描電鏡照片

為了定量了解微球致密陣列拓撲結構基底對神經干細胞形態鋪展的影響，進行了基于掃描電鏡照片的形態學測量(表1)。如表1所示，從分化第0 d到第14 d，平面基底及微球陣列上的細胞投影面積均明顯降低(P＜0．01)。在分化前，平面基底及微球陣列上的細胞具有類似的投影面積(P＞0．05);在分化第14 d，微球陣列上的細胞較之平面基底上的細胞具有更大的投影面積(P＜0．05)。

表1 H945RB．3人神經干細胞在平面基底及聚苯乙烯微球致密陣列表面的幾何測量數據

2．4 微球致密陣列拓撲結構對神經干細胞靜息膜電位建立的影響

圖5為H945RB．3人神經干細胞進行膜電位測量的激光共聚焦顯微照片。圖中顯示胞內的ROIs。胞外ROIs被定義在遠離細胞及突起的區域，其熒光強度平均值為胞外熒光強度值。表2為H945RB．3人神經干細胞在平面基底及1．98 μm微球致密陣列上分化前及分化后的靜息膜電位及內/外熒光強度比平均值。從表中可見，在細胞接種后第2 d(分化第0 d)，細胞在平面基底上的靜息電位為－71．7±28．9 mV，而細胞在微球陣列上具有更負的靜息電位(－85．7±16．3mV，P ＜0．01)。隨著分化的進行，在平面基底上的細胞于分化第7 d和第14 d時出現進一步的極化，細胞較之分化前具有更負的膜電位(P＜0．01)。與此相反，細胞在微球陣列上分化時未出現明顯的電位極化，靜息電位值與分化前無顯著性差異(P＞0．10)。在擴增條件下繼續培養至接種后第3 d和第5 d，可見在平面基底上細胞出現靜息電位的進一步極化(P＜0．01);而在微球陣列上出現靜息電位的去極化，即細胞靜息電位絕對值下降(P＜0．01)。在細胞分化的第7 d和第14 d以及擴增條件下細胞接種后的第3 d和第5 d，細胞在微球陣列上較之在平面基底上表現出明顯的相對低負的靜息電位(P＜0．01)。

圖5 H945RB．3人神經干細胞進行膜電位測量的激光共聚焦顯微照片

表2 聚苯乙希微球致密陣列對H945RB．3人神經干細胞靜息膜電位建立的影響

2．5 微球致密陣列拓撲結構對神經干細胞VGCCs功能響應性的影響

圖6示H945RB．3人神經干細胞在平面基底及1．98 μm微球致密陣列上的VGCCs功能響應性。圖中VGCCs反應性以50 mmol/L高鉀溶液刺激下的熒光強度相對增加值為指標。細胞具有反應性的判斷依據是在高鉀溶液刺激下細胞熒光強度增加15%或以上。按此標準，無論分化前或分化后第7 d及第14 d，在平面基底或拓撲結構基底上的細胞反應比率均接近100%。圖中所示為細胞熒光強度相對增加值的平均值。從圖中可見，在分化前平面基底上的細胞熒光強度相對增加值(0．86±0．46)與微球陣列上的相應值(0．88±0．70)無顯著性差異(P ＞2.5)。在分化的第7 d，平面基底上細胞的VGCCs功能響應性(0．90±0．43)較之分化前無明顯增高(P ＞2．5)，但微球致密陣列上細胞VGCCs功能響應性(1．07±0．57)較之分化前明顯增高(P＜0．05)。在分化第14 d，平面基底上細胞的VGCCs功能響應性(2．09±1．35)增加至分化前的兩倍以上(P＜0.01)，而微球致密陣列上細胞VGCCs功能響應性(4．05±2．56)增加至分化前的4倍以上(P ＜0．01)。

圖6 平面基底(空心柱)及1．98 μm微球致密陣列(實心柱)上H945RB．3人神經干細胞的VGCCs功能響應性

3 討論

Lim和Donahue[20]將拓撲結構基底分為各向異性和各向同性兩類。各向異性拓撲結構基底，如溝脊型(Groove-Ridge)基底，被廣泛用于誘導細胞定向、組織生長及組織工程材料表面設計[21]。各向同性基底主要用于研究并進一步控制細胞的粘附與鋪展等行為[5]。在各向同性拓撲結構基底中，隨機性表面(如培養皿表面納米粗糙度)盡管制備方法簡單，但顯然不適宜進行細胞－基底拓撲結構相互作用的系統研究。以此相反，陣列型拓撲結構基底的結構特征可以用簡單的幾個參數進行描述，它使得在實驗條件下系統控制拓撲結構特征研究細胞～基底拓撲結構相互作用成為可能。

考慮到細胞的尺度(10 μm ～20 μm)，微米級及亞微米級拓撲結構的加工在細胞～拓撲結構表面相互作用的研究中具有特別重要的意義。理想的微拓撲結構基底加工方法應該具備大面積和大規模快速制備能力、價格低廉以及設備技術的簡單性。盡管文獻中已有多種可用于拓撲結構基底制備的微加工方法，紫外光光刻結合軟光刻法仍為多數實驗室所能采用的基本方法[2－9]。紫外光光刻及硅蝕刻是微米級(通常 30 μm ～ 100 μm)微加工的常用方法[5，22]。利用紫外光光刻及硅蝕刻加工微結構主模，進一步采用軟光刻技術可以制備高結構(如本文達4 μm)或高縱橫比拓撲結構基底。本文以紫外光光刻結合軟光刻法制備了特征尺寸為2 μm微柱陣列拓撲結構基底，已經接近文獻報道的紫外光光刻加工的最小結構尺寸[23]。

微球自組裝及微球陣列拓撲結構的制備是一種加工拓撲結構基底的低廉、快速、簡單而不需任何特殊儀器的方法[16，24]。本研究采用簡單的傾斜角法制備了聚苯乙烯微球規則的二維六角致密陣列。盡管本研究所采用的微球直徑僅為亞微米級或2 μm，以更大的微球(100 μm以上)制備類似的陣列是可行的[13]。在二氧化硅微球拓撲結構表面的研究表明，微球拓撲結構基底可能引起細胞粘附過程的明顯障礙[24]。本研究表明，采用等離子氧蝕刻增加微球表面納米粗糙度可以使微球陣列基底具有正常的細胞粘附能力。這也提示納米粗糙度在細胞～微拓撲結構相互作用的研究中具有重要的意義。

H945RB．3人神經干細胞系由WA09人胚胎干細胞分化而來的神經上皮細胞[17]。在實驗所用的培養與分化條件下，該細胞系主要向神經元系列分化。以微球致密陣列進行的實驗表明，拓撲結構基底不僅誘導細胞粘附，而且維持細胞的鋪展形態(圖4)。定量的形態學測量表明，在細胞分化的第14 d拓撲結構基底上細胞的鋪展投影面積明顯大于平面基底上的相應值(表1)。這一結果表明，拓撲結構基底可以成為促進H945RB．3神經干細胞鋪展的有效手段。

細胞膜電位的研究表明，盡管在膜電位值計算時未能校正非電勢依賴性染料結合量，本研究所得到的靜息膜電位值與文獻中采用膜片鉗技術所測鼠神經干細胞相應值一致[25－26]。細胞靜息膜電位建立是神經干細胞功能分化的重要指標。在神經干細胞分化過程中，細胞膜電位的極化(絕對值增加)可能反應了細胞鉀通道的功能分化，而膜電位的進一步去極化可能反應了細胞靜息鈉電導及電壓依從式鈉通道的功能成熟[25，27－28]。本文研究發現，神經干細胞在分化過程中或于擴增條件下長時間培養，微球陣列拓撲結構有利于細胞維持低負的靜息膜電位值。有關這一現象的機制目前尚不清楚，推測可能與在拓撲結構上細胞鋪展使得細胞膜被牽張從而導致牽張敏感離子通道開放有關[4－6]或者拓撲結構影響離子通道的功能分化有關。

本文研究發現，在神經干細胞分化后，微球陣列拓撲結構上細胞的VGCCs功能響應幅度明顯大于平面基底上的相應值。微球陣列促進細胞鋪展及增強VGCCs功能響應性均于分化后第14 d效應最為明顯，提示二者可能具有明顯的關系。拓撲結構上VGCCs功能響應性增強的機制可能與拓撲結構上細胞低負的靜息電位或VGCCs的功能成熟有關。

4 結論

以紫外光光刻、硅蝕刻及軟光刻技術制備了微柱陣列型拓撲結構細胞培養基底。實驗條件下能制備高度為4 μm、特征尺寸大于或等于2 μm的微柱陣列型拓撲結構基底。在特征尺寸等于2 μm時，微柱結構出現倒伏或缺失。與微柱陣列型拓撲結構基底的制備相比，采用簡單的傾斜角法可以制備更寬特征尺寸范圍(從微米級到亞微米級)的微球致密陣列拓撲結構基底。微球致密陣列拓撲結構基底可以促進H945RB．3神經干細胞分化時的形態鋪展，引導神經干細胞體外較長時間培養或分化時維持低負的靜息膜電位，增強神經干細胞電壓依從式鈣通道的功能響應性。拓撲結構基底可能作為調節神經細胞鋪展行為以及離子通道功能的重要手段，這在細胞生物傳感器以及以離子通道為靶標的新藥發現中具有重要的意義。

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