胃癌組織中抑癌及相關基因的表達及其臨床意義

馬 駿 聶勝男 張建波 孟 凱 王明玉

腫瘤的發生和轉移是1個復雜的過程，其中涉及到多種癌基因的激活和抑癌基因的失活［1］。nm23作為抑癌基因，通過影響微管聚合狀態及G蛋白介導的信號通路而調節細胞代謝，在腫瘤細胞的增殖、分化和侵襲轉移中起重要作用［2］。E-cadherin作為另1種腫瘤轉移抑制基因，與nm23能夠協同抑制胃癌的轉移［3］。CD44是1種細胞表面黏附分子，標準型CD44(CD44s)主要在間質和造血細胞中表達，為透明質酸鹽的主要受體，CD44s及其變異體可在多種腫瘤中表達［4］。本研究應用免疫組化技術，檢測 nm23和 E-cadherin及CD44s基因在胃癌組織中的表達，分析其與胃癌臨床病理因素的關系，旨在探討nm23和E-cadherin及CD44s基因在胃癌的發生和轉移等過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取泰安市中心醫院2006年07月～2010年07月手術切除、并經病理檢查確診的50例胃癌標本。所有患者術前均未行化療或放療，并有完整的臨床病理資料。男性32例，女性18例。年齡25～72歲，平均年齡59.1歲，中位年齡61歲。根據UICC(1997年)第5版胃癌TNM分期標準:Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。腫瘤細胞組織學分化:高分化癌22例，中分化癌15例，低分化癌13例。有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移25例。選取30例胃癌組織標本的相應癌旁組織(距離癌灶≥2 cm)作為對照組，所有癌旁組織標本均經病理檢查證實為癌旁正常組織。

1.2 主要試劑

鼠抗人nm23和CD44s單克隆抗體購自武漢博士德生物技術有限公司，鼠抗人E-cadherin(MAB-4A2)為丹麥DAKO公司產品(1∶80稀釋);SP試劑盒、DAB顯色劑均為SantaCruz公司產品。免疫組化染色程序按試劑盒說明書進行操作。

1.3 實驗方法

4%甲醛固定標本，石蠟包埋，4μm厚連續切片。免疫組化SP法檢測步驟:3%H2O2作用20 min，消除內源性過氧化酶活性;0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗2 min×3次;10%正常羊血清37℃孵育2 h;PBS液沖洗5 min;Envision混合液室溫孵育2 h;DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知nm23和E-cadherin及CD44s陽性表達的胃癌組織切片作為陽性對照。

1.4 結果判斷標準

nm23陽性表達信號為棕黃色或深棕色，陽性產物定位于細胞質和細胞膜，呈彌散性分布;E-cadherin和CD44s陽性染色定位于細胞膜，陽性信號為棕黃色顆粒狀。所有切片均采用雙盲觀察，陽性細胞數＜5%，無染色或染色較弱，為陰性(－);陽性細胞數≥5%，染色較強，則為陽性(+)。

1.5 統計學方法

對實驗數據采用χ2檢驗和Spearman相關分析，數據計算應用SPSS12.0統計學軟件。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胃癌組織中各基因的表達情況

胃癌組織中 CD44s陽性表達率為44.5%(22/50)，癌旁組織中其陽性表達率為13.3%(4/30)，兩者比較差異有統計學意義，χ2=4.23，P ＜0.05。胃癌組織中nm23基因陽性細胞染色為黃色，定位于細胞質和胞膜。胃癌組織中其陽性表達率為48.0%(24/50)，癌旁組織中其陽性表達率為63.3%(19/30)，兩者比較差異有統計學意義，χ2=5.89，P ＜0.05。胃癌組織E-cadherin陽性染色定位于細胞膜，為棕黃色顆粒狀。胃癌組織中E-cadherin陽性表達率為52.0%(26/50)，癌旁組織為70.0%(21/30)，兩者比較差異有統計學意義，χ2=9.45，P ＜0.05。

2.2 CD44s、E-cadherin及nm23基因陽性表達與胃癌組織臨床病理特征的關系

nm23基因表達與腫瘤組織分化程度相關，隨著腫瘤組織分化程度的增加而增強，P＜0.001;Ⅰ+Ⅱ期胃癌組織中nm23陽性表達率要高于Ⅲ+Ⅳ期組織，差異有統計學意義，P=0.02;無漿膜浸潤胃癌組織中其表達率要高于有漿膜浸潤者，P=0.012;無淋巴結轉移者其表達率高于有淋巴結轉移者，P=0.001。CD44s陽性表達與腫瘤有無漿膜浸潤、淋巴結轉移和TNM 分期相關，χ2值分別為 11.62、12.58 和 9.78，P均＜0.05;CD44s陽性表達與胃癌組織分化程度無關，P＞0.05;E-cadherin陽性表達與胃癌組織分化程度、有無漿膜浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關，P均＜0.05(表 1)。

表1 抑癌及相關基因陽性表達與胃癌組織臨床病理特征的相關性(例，%)

2.3 CD44s與nm23表達的相關性

Spearman相關分析顯示，胃癌組織CD44s表達與nm23表達呈一定程度的負相關性(γ=－0.287，P＜0.05)，nm23表達與E-cadherin表達呈正相關性(γ=0.928，P=0.000)。

3 討論

腫瘤的轉移是1個非常復雜的過程，涉及一系列基因，包括轉移抑制基因和轉移促進基因。其中，nm23 和 E-cadherin 是較為明確的轉移抑制基因［4，5］。nm23基因的缺失和突變與胃癌腫瘤的浸潤和轉移有關，并與短的生存期相關［6］。nm23的編碼產物為二磷酸核苷激酶(NDPK)，nm23/NDPK可介導GDP向GTP的轉化，而這一過程與G蛋白的活性有關。Ayabe等［7］研究發現，nm23-H1基因對肺癌淋巴結微轉移可能具有抑制作用。E-cadherin與nm23有協同作用。本研究中，nm23和E-cadherin在胃癌組織中的陽性表達率均低于癌旁組織中的陽性表達率，差異有統計學意義。nm23和E-cadherin基因的陽性表達率與胃癌組織學分級、分化程度、淋巴結轉移和臨床分期等密切相關，提示其在胃癌的轉移瘤形成階段具有抑制腫瘤轉移的作用。

CD44基因位于染色體11號短臂上(11P)，共有20個外顯子構成。有關研究表明多種腫瘤的轉移行為均與CD44基因的異常轉錄有關，CD44v6是CD44蛋白變異體，它是分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白分子主要參與細胞與細胞、細胞與基質間的特異性黏附過程［2］。有文獻報道，胃癌組織中CD44s表達率為64% ～77%，而且與腫瘤的浸潤轉移密切相關［3，4］。本研究結果顯示，胃癌組織 CD44s陽性表達率為44.5%，在有、無淋巴結轉移組織中的陽性率分別為56.0%和32.0%，差異有統計學意義，提示胃癌伴淋巴結轉移者CD44s表達較高。而在有、無漿膜浸潤組織中表達率分別為51.7%和33.3%，差異有統計學意義，說明CD44s與胃癌組織的浸潤程度有相關性。

CD44s和nm23屬于黏附分子范疇，CD44s在腫瘤組織生物學行為上的作用，與黏附因子之一整合素的作用呈協同作用［8］。整合素是1種膜鑲嵌糖蛋白，由α和β兩個亞單位非共價形成異二聚體復合物。由于亞單位的變異使整合素形成1個龐大的家族。有的參與不同細胞之間的黏附連接(異源細胞間黏附)，有的則協助細胞與細胞外基質的結合，其中24β1和Mac 1同時具備上述2種功能。細胞表面的整合素可處于不活化狀態，有一些活化因子可增強整合素與相應配體的親和力，CD44s則屬于這種強化因素之一，因而，在一定程度上影響腫瘤細胞轉移潛能的高低。nm23與上皮黏連素和金屬蛋白酶組織抑制物的基因被視為腫瘤轉移抑制基因［9，10］。上皮黏連素抑制腫瘤細胞轉移的作用主要是使腫瘤細胞彼此膠著在一起，使細胞之間黏附增加，瘤細胞不易脫落而發生侵襲和轉移。有關nm23抗腫瘤轉移的機制以及CD44s和nm23在腫瘤侵襲和轉移中存在怎樣的協同或拮抗作用，有待于進一步研究。本研究顯示，胃癌組織CD44s與nm23基因的表達呈一定程度的負相關性，nm23與E-cadherin基因表達呈正相關性。

本研究通過檢測胃癌組織CD44s和E-cadherin及nm23基因的表達，發現CD44s和E-cadherin及nm23表達與胃癌腫瘤組織分期、浸潤程度和淋巴結轉移等相關，檢測其表達有助于臨床預測胃癌的轉移和侵襲程度。

［1］ 于觀貞，王杰軍，陳 穎，等.轉移相關基因nm23和 p53及S100A4在晚期胃癌中的表達及與侵襲轉移的相關性研究〔J〕.中華胃腸外科雜志，2006，9(2):165.

［2］ Steeg P S.Perspectives on classic article:metastasis suppressor genes〔J〕.JNatl Cancer Inst，2004 ，96(6):4.

［3］ 王秀麗，劉惠敏.CDX-2、PTEN、E-cadherin、NM23 在胃癌中的表達及臨床意義〔J〕.第二軍醫大學學報，2010，31(4):404.

［4］ Guan Zhen Y，Ying C，Can Rong N，et al.Reduced protein expression ofmetastasis-related genes(nm23，KISS1，KAI1 and p53)in lymph node and liver metastases of gastric cancer〔J〕.Int JExp Pathol，2007，88(3):175.

［5］ Liu GY，Liu KH，Zhang Y，et al.Alterations of tumor-related genes do notexactlymatch the histopathological grade in gastric adenocarcinomas〔J〕.World JGastroenterol，2010，16(9):1129.

［6］ Stark A M，Tongers K，Maass N，et al.Reduced metastasissuppressor gene mRNA expression in breast cancer brain metastases〔J〕.JCancer Res Clin Oncol，2005，131(3):191.

［7］ Ayabe T，Tomita M，Matsuzaki Y，etal.Micrometastasis and expression of nm23 messenger RNA of lymph nodes from lung cancer and the postoperative clinical outcome〔J〕.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2004，10(3):152.

［8］ 張景華，李 勇，王曉玲，等.胃癌及區域淋巴結CD44v-6、nm23 H1表達與其病理特征及預后關系的研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2003，31(5):256.

［9］ 吳凱彥，劉 欣，郝遠瑞.胃癌異常增生組織中CD44v6表達及其意義〔J〕.中國基層醫藥，2002，9(12):1065.

［10］ Yu X W，Xu Y，Gong Y H，et al.Helicobacter pylori inducesmalignant transformation of gastric epithelial cells in vitro〔J〕.APMIS，2011，119(3):187.