XRCC1 Codon399單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌急性放射反應的相關性研究

彭 欽 張軍寧 宋云風 南秀麗 彭小波 査燕燕

鼻咽癌在我國屬于常見惡性腫瘤，放射治療是目前首選治療手段。隨放療設備的發(fā)展和影像技術的廣泛應用，尤其是3D-CRT、IMRT的出現(xiàn)其療效進一步提高，放療不良反應也逐漸減少。但是臨床上常會出現(xiàn)一些鼻咽癌患者，病期一樣，治療技術、治療劑量相同，其療效及伴隨放療反應卻存在一定的個體差異?；颊邆€體放射生物學的差異可能是其中一個重要影響因素。本文旨在通過檢測鼻咽癌患者的XRCC1 Codon399位點的單核苷酸多態(tài)性，分析不同基因型與正常組織急性放射反應發(fā)生的相關性，為制定合理的個體化治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 資料

收集2006年9月至2008年2月蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤放療科行鼻咽癌根治放療的患者60例，其中男性52例，女性8例，年齡27～72歲，中位年齡55歲。入組條件:①經(jīng)病理檢查證實為鼻咽低分化鱗癌;②Karnofsky評分≥60;③放療前均行全身檢查，無遠處轉移;皮膚、黏膜和涎腺完整;④放療前血常規(guī)、心電圖及肝、腎功能檢查各項指標均無異常;⑤所有患者均經(jīng)CT掃描證實具有可測量的腫瘤病灶。

1.2 放療方法

所有患者均采用熱塑面罩固定頭頸肩部，行Siemens螺旋掃描，于治療計劃系統(tǒng)(TPS)精確勾畫GTV、CTV、PTV，然后于CMS治療計劃系統(tǒng)設計放療計劃。最后于模擬機下核實放療計劃后進行放射治療。

1.3 XRCC1 Codon399單核苷酸多態(tài)性檢測

放療前采集靜脈血5 ml，應用多聚酶鏈反應-鏈激酶檢測反應(PCR-LDR)技術［1］，檢測研究對象的XRCCl Arg399基因型。引物為5’TCACACCTAACTGGCATCTTCACT’3 和 5‘CTCCTTCCCTCATCTGGAGTACC3’。在PCR薄壁管中，配制20 μl多重PCR體系:10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTPs，0.5mmol/L Pfimem，1 U polymerase。加入 2 μl基因組 DNA。充分混勻，于94℃預變性15 min;94℃ 30 s、58℃ 120 s、64℃ 120 s，共35個循環(huán);64℃延伸10 min。再配制20 μl多重 LDR 體系:20 mmol/L Tris.HCl(pH 8.5)，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD+，0.2 mmol/L Probes，加入 2 μl 多重PCR產(chǎn)物，其中上游探針為5’p-GGGAGGGCAGCCGCCGACGCATGCTGCGACACTACGGAGGA–FAM3’，G探針為 5’ACGTGGACAGCTGCAGGGTTGGCGTGTGAGGCCTTACCTCC3’，A 探針為 5’TTTTTCACAGACAGGTCCCAGGGTTGGCGTGTGAGGCCTTACCTCT3’。充分混勻，然后于94℃預變性2 min;94℃ 30 s、50℃120 s，共35個循環(huán)。最后取LDR產(chǎn)物1 μl，應用測序儀測序測出XRCCl基因型。

1.4 急性放射損傷的觀察

參照RTOG急性放射損傷分級標準。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SAS 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用方差及協(xié)方差分析檢驗，雙向無序計數(shù)資料采用χ2檢驗，單向有序計數(shù)資料采用CMH(Cochran-Mamtel-Haenzsel)的χ2檢驗方法。

2 結果

2.1 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與皮膚急性放射損傷發(fā)生的關系

所有患者在放療過程中均發(fā)生了不同程度的急性皮膚放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2、3級 發(fā)生率均為33.3%;攜帶Arg/Gln基因型者1、2、3級 發(fā)生率分別為52.3%、42.9%、4.8%;攜帶 Arg/Arg 基因型者 1、2、3 級發(fā)生率分別為 57.6%、36.3%、6.1%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，此3種基因型患者皮膚急性放射損傷發(fā)生率無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.2 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與黏膜急性放射損傷發(fā)生的關系

所有患者在放療過程中均發(fā)生了不同程度急性黏膜放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2、3級發(fā)生率分別為33.3%、50.0%、16.7%;攜帶 Arg/Gln 基因型者 1、2、3 級發(fā)生率分別為 38.1%、52.4%、9.5%;攜帶Arg/Arg基因型者1、2、3級發(fā)生率分別為48.5%、42.4%、9.1%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，此3種基因型患者黏膜急性放射損傷發(fā)生率無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.3 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與涎腺急性放射損傷的關系

所有患者在放療過程中均發(fā)生了不同程度急性涎腺放射損傷，攜帶Gln/Gln基因型者1、2級發(fā)生率分別為0、100%;攜帶Arg/Gln基因型者1、2級發(fā)生率分別為33.3%、66.7%;攜帶 Arg/Arg 基因型者1、2 級發(fā)生率分別為36.4%、63.6%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，此3種基因型患者涎腺急性放射損傷發(fā)生率無顯著性差異(P ＞0.05)，見表1。

表1 XRCC1Codon399單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌患者正常組織急性放射損傷的關系(例)

3 討論

放療前腫瘤組織及正常組織放射反應性的預測是目前放射生物學的研究熱點之一，也是臨床放療醫(yī)師急需解決的問題。然而，相對于化療藥物及靶向藥物敏感性研究，放射敏感性研究的進展較慢。多年來，國內(nèi)外放射敏感性研究主要集中在用腫瘤細胞株和體外培養(yǎng)臨床腫瘤活檢腫瘤組織細胞，通過檢測電離輻射后細胞生存和復制能力、染色體畸變數(shù)量、輻射損傷后細胞修復能力以及輻射后細胞的凋亡的檢測等方面來衡量放射敏感性。近年來，隨著人類基因組計劃的實施、尤其是單核苷酸多態(tài)性方面的研究成果，為從分子水平根據(jù)個體的遺傳結構預測放射敏感性提供了新的思路。目前研究研究較多的是檢測外周血有核細胞中相關基因等單核苷酸多態(tài)性預測正常組織放射損傷及腫瘤組織放射敏感性，如TGF-β1IL-6KL-6等細胞因子單核苷酸多態(tài)性預測輻射誘導的肺損傷。

電離輻射對DNA的損傷主要涉及堿基的損傷和DNA鏈的斷裂［2］。XRCC1基因是第一個分離到的影響細胞對電離輻射敏感性的哺乳動物基因，XRCC1也是1種重要的堿基切除修復(BER)基因，它編碼的蛋白質(zhì)在堿基切除修復和DNA單鏈斷裂修復過程中都發(fā)揮重要作用。如果人體內(nèi)的DNA修復基因缺陷或發(fā)生變異，其所編碼的蛋白減少導致DNA修復基因修復能力下降。Giotopoulos等［3］對167例接受輔助放療的乳腺癌患者進行XRCC l Codon 399分析發(fā)現(xiàn)，GA基因個體與放療后毛細血管擴張顯著相關，且為毛細血管擴張發(fā)生的獨立因素。Alsbeih等［4］應用對照研究方法，對25例接受放療的頭頸腫瘤患者(無或有中至重度的皮下和深部組織的輕度纖維化)進行XRCC l Codon 399分析發(fā)現(xiàn)，XRCCl Codon 399 A基因型個體發(fā)生纖維化的風險降低(OR=0.31，95%CI=0.09～1.04，P=0.05)。MsAlsbeih 等［5］發(fā)現(xiàn) TGF-β1 和XRCC1上特定的SNPs與放射性纖維化明顯相關。本研究結果顯示:放療對正常組織的急性放射損傷與XRCC1 Codon 399基因單核苷酸多態(tài)性無顯著相關性。可能原因在于:造成人體正常組織放射性損傷的個體差異可能是多基因、多位點改變的結果;纖維增殖和炎性相關的細胞因子可能也與放射性損傷相關［6］;本研究樣本量少，今后應進一步擴大樣本量并有待于進行相關基因與位點的系統(tǒng)性研究，從而為將來個性化放療提供依據(jù)。

［1］肇 旭，秦勝營，馮國部，等.基于連接酶檢測反應的基因芯片分型技術的建立〔J〕.國際遺傳學雜志，2006，29(3):178.

［2］谷志遠，趙亞力.現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:53.

［3］Giotopoulos G，Symonds RP，F(xiàn)oweraker K，et a1.The late radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia，fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinct genotype-dependent causes〔J〕.Br J Cancer，2007，96(6):1001.

［4］Alsbeih G，Al-Harbi N，Al-Hadyan K，et al.Association between normal tissue complications after radiotherapy and polymorphic variations in TGFB1 and XRCC1 genes〔J〕.Radiat Res，2010，173(4):505.

［5］Alshaih GA，El—Sehaie MM，AI-Rajhi NM，et a1.Association between XRCC1 G399A polymorphism and late complications to radiotherapy in saudi head and neck cancer patients〔J〕.J Egypt Nail Cane Inst，2008，20(3):302.

［6］Zhao L，Wang L，Ji W ，et al.Association between plasma angiotens in converting enzyme level and radiation pneumonitis〔J〕.Cytokine，2007，37:71.