胃癌組織中Sonic Hedgehog表達及其與NF-kappaB的關系研究

嚴 華 劉海林 王海康

胃癌是1種具有較高發病率的惡性腫瘤，其形成和慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生等癌前病變密切相關。大量的流行病學調查證明，幽門螺旋桿菌感染可以導致胃黏膜細胞癌基因表達異常，同時引起炎癥反應，長期慢性炎癥可以刺激細胞增殖，而細胞增殖不僅增加了DNA自發復制錯誤的機會，同時也增加了DNA受外來突變因子損傷的可能性［1］。

Sonic Hedgehog(SHH)信號通路是自我更新信號通路之一，在人類胚胎發育過程中調控細胞增殖分化，胚胎發育成熟后進入失活狀態［2］。該通路的異常激活已被證實與胰腺癌、皮膚基底細胞癌、小細胞肺癌、前列腺癌等有關［3］。SHH信號通路可能與胃癌的發生和發展有關［4］。正常胃組織中SHH基因表達極少;而胃癌組織中SHH的表達顯著增強，這一過程與SHH基因的啟動子去甲基化有關［5］。SHH表達能促進潰瘍邊緣新生胃腺細胞的再生，在胃潰瘍修復過程中參與了胃腺細胞的分化［6］。

作為一個與胃癌發生，發展密切相關的信號分子，SHH和幽門螺旋桿菌有著復雜的相互關系。在幽門螺旋桿菌誘導的萎縮性胃炎組織中，SHH表達顯著降低［7］。而根除幽門螺旋桿菌能使腸上皮化生患者和動物模型的胃黏膜恢復 SHH表達［8，9］。

胃癌的發生是由胃黏膜干細胞突變后異常增殖、并經歷不同的癌前病變發展為胃癌干細胞［10］，而Hedgehog信號通路是調節胃黏膜干細胞和胃癌干細胞均必不可少的［11］。我們選擇了50例萎縮性胃炎、46例腸化生和57例胃癌患者的內鏡下取材的黏膜組織，同時選擇30例正常人作為對照。研究了Hedgehog在胃癌不同階段中的表達及與炎癥反應、幽門螺旋桿菌感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本組研究患者，選擇2008年11月至2010年5月我院消化科胃鏡檢查患者和上海上鋼社區衛生服務中心胃鏡檢查患者。年齡37～71歲，平均年齡(56.43±10.36)歲，包括50例萎縮性胃炎，46例腸化生和57例胃癌患者，同時選擇30例正常人作為對照;分為萎縮性胃炎組、腸化生組、胃癌組和正常組。NF-kappaB抑制劑PDTC購自Sigma公司。

1.2 Hpylori組織病理學檢測

在內鏡下取病變處黏膜3～5塊，Giemsa染色進行組織病理學檢查，Hp緊貼胃黏膜面或位于胃小凹及淺層腺腔為Hp感染陽性。

1.3 SP免疫組化檢測胃黏膜中Hedgehog和NF-kappaB表達

石蠟切片常規脫蠟、脫水，雙蒸水沖洗3 min，暴露抗原(Hedgehog)染色組采用微波爐熱抗原修復法，滴加3%H2O210 min，用 PBS沖洗3次，每次5 min，加正常血清15 min，分別滴加一抗Hedgehog和NF-kappaB(1∶100)，37℃孵育1 h后4℃過夜。用PBS沖洗3×3'，再滴加生物素標記的第二抗體，37℃孵育20 min，用PBS洗3 ×3'，最后每張切片加鏈霉素過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min，PBS洗3 ×3'，DAB顯色，蘇木精復染，0.1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片任意取10個高倍視野，計數每個視野陽性細胞數和總細胞數，計算出陽性細胞率。

1.4 細胞周期檢測

細胞周期用碘化丙啶(propidium iodide，PI)分析DNA含量，通過計算PI結合DNA后發出的熒光強度來檢測細胞倍體數，G0/G1期細胞DNA含量為2 n，G2期細胞為4 n，而S期細胞介于2 n和4 n之間。細胞以無血清1 640液或含10%血清1 640培養48 h，收集(1～2)×106細胞，離心 2 000 rpm，5 min。PBS(phosphate-buffered saline)洗1次后，一邊震蕩沉淀細胞，一邊加入75%乙醇，4℃固定至少24 h。測定細胞周期前，加入3倍固定液體積的PBS，混勻，離心2 000 rpm、5min。PBS再洗滌 1 次，離心 2 000 rpm、5 min。加10 μl RNaseA(終濃度 0.5 mg/ml)，37℃ 孵育 30 min。加PI(終濃度50μg/ml)染色，室溫置暗處15 min，流式細胞儀檢測(LSRII，Becton Dickinson)。

1.5 細胞凋亡檢測

獲取的新鮮胃黏膜細胞用膠原酶和胰蛋白酶消化后，分散成單個細胞懸液，離心2 000 rpm、5 min。PBS洗滌1次。用100μl 1×binding buffer重懸細胞，加2.5μl annexin V 和5 μl PI(終濃度為10 μg/ml)，暗處放置15 min，流式細胞儀檢測。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 幽門螺旋桿菌感染率隨胃癌發展而升高

比較各組胃黏膜樣本中Hpylori感染情況，發現正常人群中其感染率很低，為16.7%(5/30)，萎縮性胃炎和腸化生組其感染率分別為38.0%(19/50)和58.7%(27/46)，與正常組比較明顯升高(P ＜0.05)。胃癌患者中 H pylori感染率為75.4%(43/57)，不僅顯著高于正常組，也高于萎縮性胃炎組和腸化生組(表1)，這表明H pylori感染與胃癌的發生具有高度相關性，隨著疾病發展，其感染率逐漸升高。

2.2 Hedgehog和NF-kappaB在各組織中的表達情況

應用SP免疫組化法，檢測Hedgehog和NF-kappaB在各組胃黏膜組織中的表達，發現Hedgehog陽性表達率萎縮性胃炎組和腸化生組顯著低于正常組和胃癌組，與Western blot結果相似。NF-kappaB陽性表達率正常組、萎縮性胃炎組與腸化生組比較，無顯著差異，而胃癌組其陽性率顯著增高(表2)。

表1 各組中幽門螺旋桿菌感染率情況(例)

表2 各組中SHH和NF－κB陽性表達情況±s，%)

表2 各組中SHH和NF－κB陽性表達情況±s，%)

注:﹡為與正常組比較，差異有顯著性意義，P＜0.01

陽性表達正常組組別 SHH陽性表達 NF－κB 36.4 ±3.9 26.0 ±4.8萎縮性胃炎組 19.8±7.3﹡ 31.0±5.4腸化生組 25.7±8.7﹡ 34.0±5.8胃癌組 58.5±12.6﹡ 63.0±11.4﹡

2.3 細胞周期

在各組樣本中隨機選擇5例，應用流式細胞儀檢測細胞周期，發現代表靜止細胞的G0/G1期比例正常胃黏膜組較高，而萎縮性胃炎組、腸化生組和胃癌組則較低 (圖1)。

圖1 各組胃黏膜細胞的細胞周期分布

2.4 細胞凋亡

在各組樣本中隨機選擇5例，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，發現萎縮性胃炎組和腸化生組中胃黏膜細胞凋亡率較高(圖2)，分別為(33.6±2.9)%和 (34.7 ±3.4)%，顯著高于正常組(14.7 ±2.3)%和胃癌組(8.6 ±1.3)%。

2.5 胃癌細胞中SHH表達與NF－kappaB的關系

體外培養的原代胃癌細胞，經NF-kappaB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)預處理24 h后，Western Blot檢測Sonic Hedgehog蛋白表達。結果顯示，隨PDTC濃度升高，Sonic Hedgehog蛋白表達水平降低，提示Sonic Hedgehog蛋白表達可能是NF-kappaB依賴性的，見圖3。

圖2 各組樣本胃黏膜細胞凋亡率情況

圖3 NF-kappaB抑制劑對Sonic Hedgehog蛋白表達的影響A為PDTC 0μM;B為PDTC 1μM;C為PDTC 5μM;D為PDTC 10μM

3 討論

Sonic Hedgehog是機體調節胚胎干細胞和成體干細胞、維持其自我更新的信號通路之一，在細胞正常分化成熟后進入失活狀態。Hedgehog信號的異常激活導致胃黏膜細胞過度增殖而癌變。胃癌的發生是由胃黏膜干細胞突變后異常增殖、并經歷不同的癌前病變發展為胃癌干細胞［10］，而Hedgehog信號通路是調節胃黏膜干細胞和胃癌干細胞均必不可少的［11］。

為了探討Hedgehog蛋白在胃癌的多步驟發病過程中所起的作用，我們應用免疫組化技術，研究了Hedgehog在胃癌不同發展階段的表達，發現Hedgehog蛋白在癌前病變(萎縮性胃炎和腸化生)中表達最低，正常胃黏膜中等程度表達，而在胃癌中表達最高。我們的結果證實了其它學者的研究結果:在萎縮性胃炎和腸上皮化生組織中，Hedgehog表達是顯著降低的［7，12］。

那么Hedgehog在胃癌中的高表達是如何驅動的呢?我們的研究顯示隨著癌前病變向胃癌發展，幽門螺旋桿菌的感染率逐漸升高。幽門螺旋桿菌感染能在胃上皮細胞中重新激活Hedgehog表達，可能是胃癌中Hedgehog高表達的1個重要原因。

炎癥反應是幽門螺旋桿菌導致胃癌的1個重要途徑。作為炎癥反應的1個標志蛋白，NF-kappaB具有抗凋亡和促進炎癥反應的作用。我們研究發現，NF-kappaB在胃癌中的陽性表達率顯著高于其它3組，而這3組之間則無顯著差異。其他學者也發現，NF-kappaB在III型腸化生中呈高表達，提示NF-kappaB激活可能是癌前病變進入胃癌過程中的重要分子生物學事件［13］。

Sonic Hedgehog和NF-kappaB均在胃癌中呈高表達，它們之間是否存在相互關系?最近有研究發現:Sonic Hedgehog是NF-kappaB的1個新靶點，參與了后者的凋亡抵抗和促增殖作用［14］。因此，胃癌中Sonic Hedgehog高表達很可能是NF-kappaB高表達直接調控的一個結果。我們還發現:各組胃黏膜細胞凋亡率的變化趨勢和Sonic Hedgehog正好相反，即先升高后降低，進一步證實了Sonic Hedgehog的抗凋亡作用。

我們還發現，與正常胃黏膜相比，萎縮性胃炎、腸上皮化生和胃癌的細胞周期的S期比例顯著升高，但后三者之間差別不顯著。S期比例升高意味著細胞增殖加快，細胞易于積累基因損傷和加速癌變。同時，我們注意到萎縮性胃炎和腸上皮化生細胞同時具有高增殖和高凋亡的特征，可能在這類癌前病變組織中存在著較強的選擇壓力，只有那些抵抗凋亡的細胞才能存活下來。這些細胞很可能就是具有高致瘤性的胃癌干細胞，它們高表達NF-kappaB和Hedgehog，通過選擇壓力存活下來，從而導致Hedgehog蛋白有癌前病變中的低表達變為胃癌中的高表達。

總之，我們研究提出了幽門螺旋桿菌感染導致胃癌發生的可能機制:幽門螺旋桿菌—炎癥反應—NF-kappaB激活—Sonic Hedgehog表達上調—胃黏膜干細胞轉化—胃癌。與正常胃黏膜相比，胃癌癌前病變中Hedgehog呈低表達，但胃癌組織中顯著升高。本研究結果認為，通過NF-kappaB促使正常干細胞惡性轉變，使高表達Hedgehog的胃癌干細胞獲得存活優勢，可能是Hedgehog在胃癌中呈高表達的重要原因。

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