銀川產超廣譜β-內酰胺酶菌株CTX-M型耐藥基因的分布

摘要：為了了解銀川市部分醫(yī)院臨床分離的產超廣譜β－內酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ基因分布情況，采用微量肉湯法測定分離自寧夏地區(qū)兩家醫(yī)院的４５株產ＥＳＢＬｓ的大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌對１０種抗菌藥物的最低抑菌濃度，通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ）法及克隆測序分析其所產ＥＳＢＬｓ的基因型。結果顯示４５株菌株對美羅培南全部敏感，對頭孢噻肟、奈替米星、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢曲松、磺胺甲噁唑、卡那霉素的耐藥率均在６４％以上。４５株產ＥＳＢＬｓ菌株有４１株產ＣＴＸ－Ｍ型，其中ＣＴＸ－Ｍ－１４最多見，其次為ＣＴＸ－Ｍ－２８。

關鍵詞：ＥＳＢＬｓ；基因型；大腸埃希氏菌；肺炎克雷伯菌

中圖分類號：Ｒ４４６．５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2771-04

Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＣＴＸ－Ｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥＳＢＬｓ ｉｎ Ｙｉｎｃｈｕａｎ

ＤＵ Ｊｕｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＸ－Ｍ genotype ｉｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ（ＥＳＢＬｓ）－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｉｎ Ｙｉｎｃｈｕａｎ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ． Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ） ｏｆ ４５ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ to 10 antibacterial agents ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＮＣＣＬＳ ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ（ＢＭＤ）． ＰＣＲ， ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒ ＥＳＢＬｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ． Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ 45 ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ ｗａｓ １００％． Ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ＥＳＢＬｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＡＭＰ， ＫＡＮ， ＮＥＴ， ＳＭＸ， ＣＴＸ， ＣＲＯ， ＣＦ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ６４％． ４１ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ＣＴＸ－Ｍ genotype ＥＳＢＬｓ， ｍｏｓｔ ｏｆ ｗｈｉｃｈ was ＣＴＸ－Ｍ－１４ ｔｙｐｅ，next was CTX-M-28．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ＥＳＢＬｓ）； gｅｎｏｔｙｐｅ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ； Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ

隨著第三代頭孢菌素的大量使用，其耐藥菌株也隨之出現(xiàn)。經研究多數(shù)耐藥性是由細菌產生超廣譜β－內酰胺酶（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ＥＳＢＬｓ）所致，經過２０多年的研究，人們對該酶的認識不斷深入。ＥＳＢＬｓ由質粒介導，由普通的β－內酰胺酶基因（ＴＥＭ－１、ＴＥＭ－２、ＳＨＶ－１）突變而來［１］，是一類能水解氧亞氨基β－內酰胺類抗生素，可被β－內酰胺酶抑制劑所抑制的β－內酰胺酶，屬于Ｂｕｓｈ－Ｊａｃｏｂｙ－Ｍｅｄｅｉｒｏｓ的最新分類法中的２ｂｅ群。主要由克雷伯菌屬（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）和大腸埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）產生，也可由其他腸桿菌科細菌、不動桿菌以及銅綠假單胞菌產生。根據(jù)基因同源性的不同，將ＥＳＢＬｓ分為５類，ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＣＴＸ－Ｍ型、ＯＸＡ型和其他型，ＣＴＸ－Ｍ型又可細分為ＣＴＸ－Ｍ－１組、ＣＴＸ－Ｍ－２組、ＣＴＸ－Ｍ－８組、ＣＴＸ－Ｍ－９組［２－４］。不同國家、不同地區(qū)用藥的差別導致各地產ＥＳＢＬｓ腸桿菌科細菌的耐藥性和流行基因均有不同。

本研究對銀川市產ＥＳＢＬｓ腸桿菌科細菌的耐藥性及ＣＴＸ－Ｍ型基因的分布進行了分析。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株２００６年５～９月從寧夏地區(qū)兩家三級甲等醫(yī)院收集分離產ＥＳＢＬｓ菌株，經Ｖｉｔｅｋ－３２型全自動微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）的Ｖｉｔｅｋ－ＧＮＩ鑒定卡統(tǒng)一進行鑒定，得到大腸埃希氏菌３４株，肺炎克雷伯菌（Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）１１株。

１．１．２ 試劑頭孢噻肟（３０ μｇ／片）、頭孢噻肟／克拉維酸（３０／１０ μｇ／片）、頭孢他啶（３０ μｇ／片）、頭孢他啶／克拉維酸（３０／１０ μｇ／片）、頭孢曲松（３０ μｇ／片）、氨曲南（３０ μｇ／片）、奧格門丁（２０／１０ μｇ／片）等藥敏紙片；奈替米星（ＮＥＴ）、加替沙星（ＧＡＴ）、卡那霉素（ＫＡＮ）、磺胺甲噁唑（ＳＭＸ）、頭孢噻肟（ＣＴＸ）、頭孢曲松（ＣＲＯ）、頭孢噻吩（ＣＦ）、頭孢他啶（ＣＡＺ）、氨芐西林（ＡＭＰ）、美羅培南（ＭＥＭ）等抗生素標準品及Ｍ－Ｈ肉湯和Ｍ－Ｈ瓊脂培養(yǎng)基均購自北京天壇藥物生物技術公司。

１．１．３儀器ＭＪ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＴＣ－２００型ＰＣＲ儀、ＢＩＯ－ＲＡＤ凝膠成像儀、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０型酶標儀等。

１．２方法

１．２．１菌株的ＭＩＣ和耐藥性分析按ＮＣＣＬＳ推薦的微量肉湯稀釋法［５］測定各抗生素對實驗菌株的最低抑菌濃度（ＭＩＣ），考察各菌株的耐藥性。以大腸埃希氏菌ＡＴＣＣ２５９２２和肺炎克雷伯菌ＡＴＣＣ７００６０３為標準質控菌株。

１．２．２ＣＴＸ－Ｍ基因型鑒定①ＰＣＲ擴增：根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ登錄的各型ＥＳＢＬｓ基因序列設計合成ＣＴＸ－Ｍ－１、ＣＴＸ－Ｍ－２、ＣＴＸ－Ｍ－８、ＣＴＸ－Ｍ－９ ４對特異性引物（表１），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，以堿裂解法抽提的４５株待檢菌株的質粒為模板，ＰＣＲ反應以５０ μＬ體系進行，其產物進行含０．５ μｇ／ｍＬ ＥＢ的１．２％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照相。②基因序列測定及比對：將凝膠電泳確定的ＥＳＢＬｓ陽性ＰＣＲ產物純化后送到上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將所測序列在基因數(shù)據(jù)庫中比對分析，確認其基因型。

２結果

２．１產ＥＳＢＬｓ菌株的耐藥性ＭＩＣ

由表２可見，產ＥＳＢＬｓ的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌對美羅培南全部敏感，對頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩、奈替米星和卡那霉素的耐藥率均高于６４．００％，對磺胺甲噁唑和氨芐西林的耐藥率均為１００．００％；對于加替沙星，產ＥＳＢＬｓ的大腸埃希氏菌耐藥率為８５．２９％，而產ＥＳＢＬｓ的克雷伯氏菌耐藥率為３６．３６％；對于頭孢他啶，產ＥＳＢＬｓ的克雷伯氏菌耐藥率為６３．６４％，產ＥＳＢＬｓ的大腸埃希氏菌耐藥率為２３．５３％。質控菌株的結果符合ＮＣＣＬＳ標準。

２．２ＣＴＸ－Ｍ基因型鑒定結果

２．２．１ＰＣＲ擴增結果瓊脂糖凝膠電泳對ＰＣＲ擴增產物檢測的結果顯示共擴增得到５１條ＥＳＢＬｓ陽性條帶，包括２２條ＣＴＸ－Ｍ－１組基因（４３．１４％），２９條ＣＴＸ－Ｍ－９組基因（５６．８６％）。未發(fā)現(xiàn)ＣＴＸ－Ｍ－２、ＣＴＸ－Ｍ－８的擴增產物，圖１是部分ＣＴＸ－Ｍ－１、ＣＴＸ－Ｍ－９組基因擴增產物電泳結果。

２．２．２產ＥＳＢＬｓ菌株主要基因型分布測序結果顯示２２株ＣＴＸ－Ｍ－１組中有１２株為ＣＴＸ－Ｍ－２８型，有４株ＣＴＸ－Ｍ－２２型，有３株ＣＴＸ－Ｍ－１５型，有２株ＣＴＸ－Ｍ－３型，有１株ＣＴＸ－Ｍ－５５型；２９株ＣＴＸ－Ｍ－９組全部為ＣＴＸ－Ｍ－１４型。

所檢測的４５株細菌中，有４１株產ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ，占所有菌株的９１．１１％，其中３１株細菌產單個ＥＳＢＬｓ基因型，包括１９株產ＣＴＸ－Ｍ－１４型，７株產ＣＴＸ－Ｍ－２８型，２株產ＣＴＸ－Ｍ－１５型，產ＣＴＸ－Ｍ－３型、ＣＴＸ－Ｍ－２２型、ＣＴＸ－Ｍ－５５型各１株；１０株細菌同時產２種ＥＳＢＬｓ基因型，包括５株產ＣＴＸ－Ｍ－２８＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型，３株產ＣＴＸ－Ｍ－２２＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型，產ＣＴＸ－Ｍ－３＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型、ＣＴＸ－Ｍ－１５＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型各１株。４１株產ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ菌株的具體基因型分布見表３。

３討論

３．１產ＥＳＢＬｓ菌株的耐藥性

產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌株和克雷伯氏菌株不僅對第一、三代頭孢菌素耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等交叉耐藥。抗菌藥物的大量使用是形成細菌多重耐藥性的重要誘因，這可能與各地區(qū)的用藥習慣有關。目前認為碳青霉烯類抗生素如美羅培南是治療產ＥＳＢＬｓ菌感染的首選藥物。本實驗藥敏結果亦顯示其對產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌株和克雷伯氏菌株有良好的抗菌活性，敏感率均為１００％，可作為治療產ＥＳＢＬｓ菌株的首選藥物；第三代頭孢菌素類藥物頭孢他啶對產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌株的抗菌活性只有76．47％，喹諾酮類抗生素加替沙星對產ＥＳＢＬｓ克雷伯氏菌株的抗菌活性只有63．64％，與國內的一些報道有些差異，這可能與產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌株和克雷伯氏菌株的基因型和廣譜酶的產生量有關，也可能與寧夏地區(qū)臨床治療所使用的藥物有關；產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌株和克雷伯氏菌株對氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢噻肟、磺胺甲噁唑、卡那霉素、奈替米星的耐藥率均在６４％以上，故建議在治療此類感染時應盡量避免上述種類抗生素的使用。

３．２產ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ菌株的基因型

ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ含有多種型別，世界各地區(qū)流行的型別有所不同。西班牙主要流行ＣＴＸ－Ｍ－９、ＣＴＸ－Ｍ－１０、ＣＴＸ－Ｍ－１４［６－８］；日本、臺灣流行ＣＴＸ－Ｍ－３［9-11］；中國主要流行ＣＴＸ－Ｍ－９組ＥＳＢＬｓ［１２－１４］，未發(fā)現(xiàn)ＣＴＸ－Ｍ－２組和ＣＴＸ－Ｍ－８組ＥＳＢＬｓ，與本實驗結果相符。北京地區(qū)以產ＣＴＸ－Ｍ－３ ＥＳＢＬｓ菌株最多，而浙江、新疆及鄭州主要是產ＣＴＸ－Ｍ－１４ ＥＳＢＬｓ，地區(qū)之間基因型的差別可能是由于各地區(qū)抗菌藥物的使用不同及醫(yī)院內攜帶ＥＳＢＬｓ基因耐藥質粒的流行有關［１５］。

產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌一般只攜帶一種ＣＴＸ－Ｍ基因型，近年來已有關于同時攜帶兩種或兩種以上ＣＴＸ－Ｍ基因型菌株的報道［１３，１４］。在本研究中，４１株產ＥＳＢＬｓ基因的菌株有３１株攜帶一種ＣＴＸ－Ｍ基因型，１０株攜帶兩種ＣＴＸ－Ｍ基因型，這也可能是導致寧夏地區(qū)產ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌存在多重耐藥性的原因。研究結果表明，隨著β－內酰胺類抗生素特別是第三代頭孢菌素的不斷增量使用，監(jiān)測產ＣＴＸ－Ｍ型、ＴＥＭ型、ＳＨＶ型和其他型ＥＳＢＬｓ的菌株有重要意義，尤其要密切監(jiān)視ＣＴＸ－Ｍ型基因的突變和傳播，從而為臨床合理使用抗生素提供可靠的依據(jù)。

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