小白菜內生菌的分離及菌核菌拮抗菌的篩選

摘要：利用選擇培養(yǎng)基對茂名市郊區(qū)種植的成熟小白菜植株進行內生菌分離，共得到３株內生細菌、５株內生真菌、２株內生放線菌。細菌分屬芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、黃色桿菌屬，真菌主要為曲霉屬、毛霉屬，放線菌分屬鏈霉菌屬和諾卡菌屬。利用平板對峙培養(yǎng)法篩選出２株內生放線菌及１株內生細菌對植物菌核病菌有強拮抗作用。

關鍵詞：小白菜；內生菌；菌核菌；拮抗菌

中圖分類號：S476+.19文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2676-04

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Eｎｄｏｐｈｙｔｅ ａｎｄ Sｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｃｌｅｒｏｔｉａ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Pａｋｃｈｏｉ

ＬＩＵ Ｊｉｅ－ｆｅｎｇ，ＺＨＯＵ Ｔｉａｎ，ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ，ＨＡＮ Ｈａｎ－ｂｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｏｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍａｏｍｉｎｇ ５２５０００，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｒｅｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ， ｆｉｖｅ ｆｕｎｇｉ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｗｏ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗeｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ from ｍａｔｕｒｅ ｐａｋｃｈｏｉ ｐｌａｎｔｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Mａｏｍｉｎｇ ｓｕｂｕｒｂ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ． Ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃｏｈｎ， Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ， Ｍｕｃｏｒ， Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｄ Ｎｏｃａｒｄｉａ． Ａｍｏｎｇ the eight ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａ， ｔｗｏ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ one ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｈａd ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ against Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ confront antibiotic culture．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｋｃｈｏｉ； eｎｄｏｐｈｙｔｅ； Ｓｃｌｅｒｏｔｉａ ｂａｃｔｅｒｉａ； aｎｔａｇｏｎｉｓｍ

植物內生菌是指整個生活史或生活史的某一階段生長在植物組織細胞間隙或細胞內而不引起明顯病害癥狀的微生物。植物內生菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，大量研究結果表明，內生菌在植物體內占據有利于生防的生態(tài)位，具有抗病蟲害［１－４］、植物促長［５，６］、增強宿主抗逆境［７］等功能。近年來，植物內生菌的生理作用［８－１２］及其作為潛在的生防資源［１３－１５］已逐漸成為國內外研究的熱點。

小白菜是蔬菜中含礦物質和維生素最豐富的蔬菜，在我國南方廣泛種植。小白菜富含抗過敏的維生素Ａ、維生素Ｃ、維生素Ｂ族、鉀、硒等，小白菜有利于預防心血管疾病，降低患癌癥危險性，并能通腸利胃，促進腸管蠕動，保持大便通暢，還能健脾利尿，促進吸收，而且有助于蕁麻疹的消退等功效。

蔬菜菌核病是一種由菌核菌［Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｎｍ（Ｌｉｂ）ｄｅ Ｂａｒｙ］感染，寄主廣泛，難以防治，對生產有嚴重損失的作物病害。隨著生活水平的提高和環(huán)保意識的增強，人們對自身健康的關注和對無公害食品要求也越來越高。因此，農作物的低污染生物防治將逐步部分或全部替代化學藥物防治，其中通過植物內生菌的生物防治更是人們關注的焦點。國內外學者在油菜、柑橘、瓜類等果蔬的菌核病生物防治方面開展了廣泛研究，并取得了一定成效，但是對生長期短的蔬菜菌核病生防研究則少見報道。

在對茄類內生菌分離及拮抗菌篩選工作的基礎上［１６］，本試驗對茂名市郊區(qū)大面積種植的小白菜的內生菌進行分離，并對常見病原菌核菌的拮抗內生菌進行篩選，目的在于探索新的防治植物菌核菌病的有效途徑，為提高本地區(qū)蔬菜的質量提供基礎理論數據。

１材料與方法

１．１供試材料

健康的小白菜采自茂名郊區(qū)菜園。病原菌為從染病的小白菜根莖葉中分離得到。

１．２培養(yǎng)基

１）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏０．５％，蛋白胨１．０％，ＮａＣｌ ０．５％，瓊脂１．５％～２．０％，ｐＨ值７．４。加入５０ ｍｇ／Ｌ重鉻酸鉀抑制真菌生長。

２）高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：可溶性淀粉２．０％，ＫＮＯ３ ０．１％，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＮａＣｌ ０．０５％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．００１％，瓊脂１．５％～２．０％。ｐＨ 值７．４。加入５０ ｍｇ／Ｌ重鉻酸鉀抑制真菌生長。

３）馬鈴薯培養(yǎng)基（ＰＤＡ）：馬鈴薯浸出液２０％，蔗糖２％，瓊脂１．５％～２．０％，自然ｐＨ值。加入２５０ Ｕ／Ｌ的氨芐青霉素抑制細菌生長。

４）拮抗試驗培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，加入２０％的小白菜研磨浸出液。液體培養(yǎng)不加瓊脂。

以上培養(yǎng)基均在１２１ ℃滅菌２０ ｍｉｎ。

１．３內生菌及供試菌的分離與純化

１．３．１內生菌的分離與純化采回的植株用流水沖洗干凈，剪成小段，７５％酒精中浸泡３ ｍｉｎ，再用１０％次氯酸鈉浸泡一定時間：莖為８ ｍｉｎ，根和葉由于氣孔較莖大，浸泡５ ｍｉｎ即可，然后用無菌水浸泡多次，每次３ ｍｉｎ，表面消毒檢測至漂洗液無菌落長出為止，一般為３～４次。在無菌條件下用適量的ＰＢＳ緩沖液搗碎，充分攪拌后靜置３ ｍｉｎ，取上清液０．５ ｍＬ分別涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每種材料做３次平行，以最后一次的漂洗液作對照，３０ ℃下培養(yǎng)一個星期。挑取不同形態(tài)的菌落，平板劃線進行３～４次的傳代純化、鏡檢、斜面低溫保存。

１．３．２病原菌核菌的分離選取具有明顯菌核菌病癥的小白菜，采用常規(guī)組織分離方法從長菌絲及菌核處取樣，接種于ＰＤＡ培養(yǎng)基中（添加１０％的

１／３ ０００孟加拉紅溶液），３０ ℃培養(yǎng)至長出白色菌絲后，取白色菌絲進行多次劃線純化至純種，斜面低溫保存。

１．４內生拮抗菌的篩選與活性測定

把分離得到的內生菌與菌核菌分別于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中連續(xù)活化３次，每次間隔２４ ｈ，使菌株處于生長旺盛期。把內生菌接種于平板培養(yǎng)基的一側，于相隔２ ｃｍ的培養(yǎng)基上接種菌核菌。３０ ℃培養(yǎng)，以不接供試菌為對照，２４ ｈ后觀察。

對菌核菌有拮抗作用的內生菌進行液體培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)４８ ｈ，真菌或放線菌培養(yǎng)６ ｄ，發(fā)酵液過濾除菌后，按２０％濃度混合到平板培養(yǎng)基中，接種菌核菌３０ ℃培養(yǎng)，以不加發(fā)酵液作對照，２４ ｈ后觀察。

１．５菌株的鑒定

1）內生菌鑒定：根據分離菌的培養(yǎng)特性及菌體菌落形態(tài)特征、銀鹽染色、革蘭氏染色及生理生化反應等，參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版及《真菌鑒定手冊》對分離得到的內生菌株進行鑒定分類。

2）病原菌鑒定：根據分離菌在ＰＤＡ培養(yǎng)基上的菌落和菌核形成等培養(yǎng)性狀特征，結合柯赫準則及文獻［１７］對染菌核病植株特征的描述，確定病原菌種屬。

２結果與分析

２．１內生菌的分離結果

采用研磨液培養(yǎng)法，利用選擇培養(yǎng)基對健康的小白菜植株進行內生菌分離，平板劃線法純化，得到內生菌在不同組織中的定殖情況見表１。共得到菌落形態(tài)不同的３株內生細菌、５株內生真菌、２株內生放線菌，編號見表２，其中ｘｂｃ－ｂ①、ｘｂｃ－ｆ①、ｘｂｃ－ｆ③在小白菜的根、莖、葉均有分布。實驗結果表明，由于各植物的器官所處生態(tài)位不同，導致同種植株不同的部位侵染的內生菌種類及數量均有差異，小白菜中根部分離得到的內生菌相對較多，內生菌種類中真菌的分離幾率最大。可見，小白菜中的內生菌主要由土壤或由種子傳導。

２．２內生菌及病原菌的鑒定

２．２．１內生菌參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版及《真菌鑒定手冊》，依據菌體和菌落的形態(tài)、鞭毛有無、革蘭氏染色、生理生化反應等，對１０株內生菌進行初步鑒定分類，結果見表２。

２．２．２病原菌

１）菌落特征：在ＰＤＡ培養(yǎng)基上菌落白色，放射狀生長，疏松，緊貼于培養(yǎng)基的表面，圓形，邊緣整齊，２４ ｈ后擴散到整個培養(yǎng)皿。

２）菌絲形態(tài)：顯微鏡下可見菌絲無色、分枝直角、有橫隔，后期能相互扭集成小白點，再形成菌核。

３）菌核特征：初形成的菌核乳白色，后轉為淡黃色，最后茶褐色，表面光滑，球形或橢圓形，有時２～４個菌核相互粘連在一起，培養(yǎng)基上菌核直徑０．５～１．０ ｍｍ。

４）致病性：用刺傷法把病原菌純種的菌絲塊和菌核接種于健康小白菜莖上，植株接種菌絲２～３ ｄ后莖基部淡褐色并被白色絹絲狀菌絲包圍，接種菌核的植株５ ｄ后也出現同樣癥狀，６～８ ｄ后植株莖基部腐爛倒伏，全株死亡，而對照沒發(fā)病。

根據上述致病性特點、病原菌形態(tài)和培養(yǎng)性狀，分離到的病原菌與文獻［１２］對白絹病病菌及其所致病害癥狀的描述，初步鑒定為羅氏白絹小菌核菌（Ｓｃｌｒｏｔｉｕｍ ｒｉｌｆｓｉｉ Aｃｃａｒｄｏ）。

２．３菌核菌的抑制試驗結果

把分離、純化的１０株內生菌分別與羅氏白絹小菌核菌進行對峙試驗，部分結果如圖１、２、３、４。

試驗結果表明，１０株內生菌中有2株放線菌和１株細菌對羅氏白絹小菌核菌有較強的抑制作用，病原拮抗菌分別為：鏈霉菌屬（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、諾卡菌屬（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）。

病原菌核菌在３種分別含３株拮抗內生菌發(fā)酵液的平板培養(yǎng)基中的生長情況顯示，病原菌核菌在諾卡菌發(fā)酵液培養(yǎng)中生長良好，受抑制作用不明顯，而在另2種內生菌發(fā)酵液培養(yǎng)基生長均受到抑制，菌落出現較晚，菌絲明顯減少。表明諾卡菌屬菌株對菌核菌的抑制作用可能是由營養(yǎng)或空間引起的競爭抑制，而鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬兩株內生菌的抑制作用主要是其代謝產物的影響。

３結論

１）利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基３種培養(yǎng)基外加抑制劑對小白菜植株的根、莖、葉進行內生菌分離，共得到３株內生細菌、５株內生真菌、２株內生放線菌。

２）用平板對峙培養(yǎng)法進行內生拮抗菌的篩選結果表明，分離得到的１０株內生菌中有２株放線菌和１株細菌對菌核病原菌有較強的拮抗作用，其中的2株內生菌可能是由其代謝產物引起的抑制。

３）通過菌落及菌體的形態(tài)特征、鞭毛有無、革蘭氏染色、生理生化反應等方法對１０株內生菌進行初步鑒定歸屬，細菌分別為芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、黃桿菌屬；真菌主要為曲霉屬和毛霉屬，放線菌為鏈霉菌屬和諾卡菌屬。通過菌落和菌核形成等培養(yǎng)性狀特征，結合柯赫準則對病原菌初步鑒定為羅氏白絹小菌核菌（Ｓｃｌｒｏｔｉｕｍ ｒｉｌｆｓｉｉ Aｃｃａｒｄｏ）。內生菌中對菌核菌有拮抗作用的是鏈霉菌屬（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、諾卡菌屬（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）。

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