利用鹽溶蛋白UTLIEF技術快速鑒定玉米種子純度

摘要：利用鹽溶蛋白超薄等電聚焦電泳技術對６個同父異母、５個同母異父共１１個玉米雜交品種種子進行純度鑒定。結果顯示，鹽溶蛋白超薄等電聚焦電泳圖譜帶型穩定，多態性豐富，分辨率高，可將供試的血緣關系較近的玉米雜交品種區分開，而且該技術操作簡便，可用于玉米種子純度的快速鑒定。

關鍵詞：玉米；鹽溶蛋白；超薄等電聚焦電泳；純度鑒定

中圖分類號：Ｓ５１３文獻標識碼：Ｂ文章編號：0439－８114（２０11）13－2613-02

The Application of Salt-soluble Proteins UTLIEF in Maize Purity Identification

ＺＨＥＮ Ｇｕａｎｇ－ｔｉａｎ

（Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＴＬＩＥＦ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １１ ｍａｉｚｅ ｈｙｂｒｉｄｓ（５ ｏｆ ｔｈｅｍ shared a ｓａｍｅ ｆａｔｈｅｒ ａｎｄ ６ ｏｆ ｔｈｅｍ shared a ｓａｍｅ ｍｏｔｈｅｒ） ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＴＬＩＥＦ ｃｏｕｌｄ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ １１ ｍａｉｚｅ ｈｙｂｒｉｄｓ as ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｈａｄ ｓｔａｂｌｅ ｓｔｒｉｐ， ｇｏｏｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ was ｅａｓｙ ａｎｄ ｃould ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）； ｓａｌｔ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＵＴＬＩＥＦ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

近年來，由于玉米骨干自交系的使用日益集中，導致我國玉米種質遺傳基礎日趨狹窄，利用傳統的形態鑒定方法難以鑒定血緣關系較近的玉米雜交種，利用分辨率高的ＤＮＡ分子標記鑒定方法不但投資昂貴，而且費時費力，并非一般單位所能承受得起［1］。種子鹽溶蛋白超薄等電聚焦電泳

（ＵＴＬＩＥＦ）技術被認為是一種簡便、快速、可靠且成本較低的鑒定方法，已被寫入國際種子測試協會（ＩＳＴＡ）的種子檢驗規程［2］。本研究以遼寧地區種植的６個同父異母和５個同母異父共１１個玉米雜交品種為試驗材料，研究利用種子鹽溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ技術鑒定玉米種子純度的可行性。

１材料與方法

１．１試驗材料

供試的１１個玉米雜交品種及其親本（表１）均為沈陽市農業科學院近年來育成。

１．２蛋白質提取

每個品種設３次重復，每次重復隨機取５０粒種子。將單粒種子用電動種子粉碎機（北京市六一儀器廠）粉碎，裝入１．５ ｍＬ離心管中，加入蛋白質提取液靜置提取１．０～１．５ ｈ，用渦旋振蕩器振蕩混勻處理１ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液備用。

１．３超薄層聚丙烯酰胺凝膠制備

將１片Ｇｅｌ－Ｆｉｘ聚酯膠片（２６７ ｍｍ×１９３ ｍｍ，購自ＧＥ公司）放在玻璃板上，將５ ｍＬ凝膠液（內含凝膠貯存液５ ｍＬ、牛磺酸０．１６ ｇ、尿素０．８ ｇ、ｐＨ值５～９的Ｓｉｎｕｌｙｔ ２２０ μＬ、０．２ ｇ／ｍＬ的ＡＰＳ ３０ μＬ、ＴＥＭＥＤ ６ μＬ）倒在聚酯膠片上，蓋上涂有疏水硅烷的玻璃板，靜置４５ ｍｉｎ以上，待凝膠完全聚合后打開模具，取出凝膠。因上面玻璃板兩條長邊均貼有厚度為０．１２ ｍｍ的電工膠布作為上下兩板間隔，所以制出的聚丙烯酰胺凝膠厚度即為０．１２ ｍｍ。

１．４超薄層等電聚焦電泳

將帶有凝膠的聚酯膠片放置在水平平板電泳槽的冷卻板上。把經正、負電極緩沖液充分濕潤的電極紙條分別放于凝膠兩端。在離正極電極條１．５ ｃｍ處放置點樣帶（５２孔），向點樣孔中加入２０ μＬ蛋白質提取液。聚焦溫度設定為４ ℃，電泳８０ ｍｉｎ聚焦完成（首先將電泳電壓設定為６００ Ｖ電泳３０ ｍｉｎ，然后再將電壓升至１ ０００ Ｖ電泳５０ ｍｉｎ）。將聚焦后的膠片在０．１２ ｇ／ｍＬ的三氯乙酸中固定２０ ｍｉｎ，經考馬斯亮藍染色液染色５０ ｍｉｎ，然后脫色２０ ｍｉｎ，于室溫下晾干，過夜。凝膠晾干后經掃描儀（上海中晶科技有限公司）掃描，得到ＵＴＬＩＥＦ圖譜。

１．５結果統計與分析

通過分析ＵＴＬＩＥＦ圖譜，統計異常帶型的樣本數量，按下列公式計算品種純度：

品種純度＝（供試種子數－異粒數）／供試種子數×１００％

２結果與分析

通過對１１個玉米雜交品種單粒種子鹽溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ圖譜的分析，發現其鹽溶蛋白超薄等電聚焦電泳圖譜帶型穩定，多態性豐富，分辨率高，可將供試的血緣關系較近的玉米雜交品種區分開，而且該技術操作簡便，可用于玉米種子純度的快速鑒定。以沈單１６號和沈玉２３號為例，單粒種子鹽溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ的電泳圖譜如圖１和圖２。沈單１６號（圖１）與沈玉２３號（圖２）的帶型明顯不同，而且在圖１中，９號樣本的帶型與其他種子明顯不同，因此認為９號樣本為混入的其他品種的種子。圖２中１０號樣本的帶型與其他種子明顯不同，可確定為母本自花授粉子粒或混入的其他品種的種子。通過統計異常帶型的樣本數量，依據上述公式，計算各供試品種的純度，鑒定結果如表２。

３討論

玉米種子貯藏蛋白質具有遺傳差異表達穩定、多態性豐富和提取容易等特點，因而作為鑒別品種間遺傳差異的重要生化標記，在品種純度檢驗上有著非常重要的意義［3，4］。通過改進的ＵＴＬＩＥＦ，本研究分離到的玉米種子鹽溶蛋白質譜帶有十幾條到幾十條不等，足夠通過分析多態性鑒定其純度。研究結果顯示，單粒種子鹽溶蛋白ＵＴＬＩＥＦ圖譜提供了親緣關系較近的品種在蛋白質水平上的較大變異，依據這些變異，可有效地鑒定品種純度。該試驗提供的鑒定技術采用的電泳設備和兩性電解質試劑均實現了國產化，大大節約了成本，但在技術的標準化、結果分析及標準品種電泳圖譜的建立等方面還需要做進一步研究。

參考文獻：

［１］ 張余良．農業種子真偽鑒別與防偽的進展［Ｊ］．天津農業科學，１９９８，４（１）：５３－５６．

［2］ ＧＢ／Ｔ３５４３－１９９５，農作物種子檢驗規程［Ｓ］．

［3］ 嚴敏，趙延明，趙婷，等，基于超薄等電聚焦電泳技術的雜交水稻種子純度鑒定［Ｊ］．中國農學通報，２００７（１２）：２１－２５．

［4］ 王曉峰，趙婷．超薄等電聚焦電泳技術及其在種子純度鑒定中的運用［Ｊ］．種子，２０００（６）：５５－５７．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文