骨折一號方對家兔骨折VEGF和BMP 2表達影響的實驗研究

易 洋,鮑運平,龔朝霞朱正榮,彭禮林,駱華松 (長江大學臨床醫學院荊州市第一人民醫院骨科,湖北荊州434000)李軍川 (長江大學臨床醫學院荊州市第一人民醫院病理科,湖北荊州434000)

骨折一號方是我科協定方,臨床實踐證實其療效卓著,為進一步深入研究骨折一號方的作用機理,我們設計了本次實驗。采用家兔橈骨中下1/3處1.5mm骨質缺損的動物模型,應用組織學、免疫組化方法對骨折一號方對骨折愈合的作用和骨折愈合過程中骨痂血管內皮生長因子 (VEGF)、骨形態發生蛋白-2(BMP-2)表達的影響進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗藥物 骨折一號方由荊州市第一人民醫院制劑科提供。處方組成:澤蘭、二花、紅花、三七等。用傳統煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,備用。生理鹽水、青霉素 (華北制藥)均由荊州市第一人民醫院藥劑科提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設備 VEGF、BMP-2試劑盒 (即用型,武漢博士德生物有限公司提供)、臺式自動平衡離心機LDZS-2(北京醫用離心機廠)、HC-TP12B-1型天平 (北京醫用天平廠)、全自動切片機RMZ145(德國萊卡)、電熱恒溫水箱BHW(北京市醫療設備廠)、全自動病理切片包埋機 (德國萊卡EGll60)、DJS-941型電動石膏鋸 (長江大學提供)、電熱鼓風干燥箱101A-1(上海市實驗儀器總廠)、顯微鏡MICROPHOT-FXA(日本NIKON)、外科常用器械 (由長江大學分子生物學實驗室提供)。

1.1.3 實驗動物 選擇健康8月齡雄性新西蘭大白兔60只,體質量2.5～3.0kg,由長江大學醫學院實驗動物中心提供。動物飼養于清潔級環境下 (長江大學醫學院實驗動物中心),自由進食顆粒飼料,飲消毒水,室溫控制在 (20±2)℃,濕度60%,12-12間隔照明,定期紫外線消毒與排風。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 實驗動物用0.3%戊巴比妥鈉按30mg/kg體質量耳緣靜脈注射麻醉后建立動物模型,右側橈骨術野處剪毛,2%碘酒、70%酒精消毒,取前臂外側切口,暴露橈骨中段,注意保護橈動、靜脈,用兩把骨膜剝離子將橈骨撬起,DJS-941型電動石膏鋸造成橈骨中段1.5mm的骨缺損。以出現假性關節為準。徹底止血,關閉切口。手術過程均在嚴格無菌條件下進行。術后分籠飼養,自由進食,不做固定。術后進行3d抗感染治療,給予青霉素80萬單位肌肉注射,1次/d。造模成功后隨機分為3組,空白組 (A組)、生理鹽水對照組 (B組)和骨折一號方組 (C組),每組20只。

1.2.2 給藥方法 用傳統煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,按 “動物與人體的每千克體重劑量折算系數表”[1]折算成等效劑量,2ml/100g體質量灌胃,從造模后第1天開始,2次/d,直至動物被處死。

1.2.3 標本處理 術后第3、6、9、14天每組隨機抽取5只家兔,采用空氣栓塞法處死,取樣時均截取右側橈骨,包括原骨折斷端及遠近端各長約1.5cm的正常骨質,并剔除其上的軟組織。置于質量分數為40g/L的多聚甲醛 (含1‰DEPC)4℃下固定24h。

1.2.4 組織學檢查 以骨折端中央為中心縱行剖開骨段,經系列酒精脫水、透明、浸蠟,剖面向下,低熔點石蠟包埋。用萊卡自動切片機切成厚度6μ m的蠟片,將蠟片分別展于經多聚賴氨酸處理的載玻片上,標明相應的組織號碼,置于干燥箱中,42℃烤片48h。采用HE染色對各組標本的骨折愈合情況進行觀察評價。

1.2.5 VEGF表達檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產的VEGF免疫組化S-P試劑盒對標本VEGF的表達進行免疫組化檢查。

1.2.6 BMP-2表達檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產的BMP-2免疫組化S-P試劑盒對標本BMP-2的表達進行免疫組化檢查。

1.2.7 圖像分析 NIKON MICROPHOT-FXA顯微鏡的光源設定在電壓4.9V,物鏡固定為×40,光柵孔徑為0.25mm,曝光時間為0.165s,色溫為5500K,敏感度為M。拍攝在攝像機的鏡頭打開無組織和鏡頭完全被遮蔽狀態下的照片,作為光密度分析中黑色階和入射色階的校準圖像。以骨折為中心對骨折斷端附近的骨干細胞、骨外膜、骨內膜、血腫、纖維骨痂、軟骨骨痂、骨小梁、小梁間組織及骨髓組織各取兩個高倍鏡視野。用Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,對陽性反應細胞的平均光密度值(MOD)進行分析。簡要分析步驟:打開Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,用校準圖像的灰度值設定光密度系統的黑色階和入射色階,并將光密度設為系統默認值。打開需要測量的圖像,用選擇顏色中的吸管工具選擇圖像中的棕黃色陽性反應區域,并保存選擇的顏色數據,根據大量圖像調整顏色數據,確定標準數據,其他圖像用此數據自動選取圖像中陽性表達區域。使用AOI工具劃定需要測量的組織范圍,并手工去除噪點后計算該組織陽性表達細胞的MOD值,保存測量結果。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 HE染色結果

術后第3天,各組切片顯示以纖維組織為主,可見間充質細胞增殖活躍,內有毛細血管及炎性細胞;術后第6、9天,骨折一號方組膠原纖維較多,分化較成熟,對照組膠原纖維較少。術后第14天,骨折一號組有大量軟骨細胞及成骨細胞,成纖維細胞多呈圓形,成骨細胞較大,細胞外基質生成較多;空白組及對照組膠原纖維較多,軟骨細胞和成骨細胞數量相對較少,排列稀疏。

2.2 各組標本骨干細胞VEGF表達

各組標本在骨折愈合不同時間點骨干細胞VEGF表達情況見表1。

2.3 各組標本骨干細胞BMP-2表達

各組標本在骨折愈合不同時間點骨干細胞BMP-2表達情況見表2。

表1 不同觀察時間各組標本骨干細胞VEGF表達情況

表2 不同觀察時間各組標本骨干細胞VEGF表達情況

3 討 論

骨折愈合是一個復雜過程,經膠原合成、膠原纖維內鈣化、骨化等,最終形成具有生物力學特性的骨組織[2]。近年的研究已經證明,影響骨折愈合的因素有很多,但目前一般認為血管方面因素可能是影響骨折修復的主要因素之一。已有研究表明,EGF可以促進創傷后的血管生成和骨形成[3-4]。

本實驗中VEGF表達檢測結果顯示,骨折后斷端均有VEGF表達。術后第3、9天出現兩個峰值。我們對各時相點VEGF表達量作比較分析后發現,試藥組較對照組各時相點VEGF表達量均明顯增高,表明骨折一號方有促進骨折后VEGF表達的作用,且在VEGF表達量下降過程中可明顯減慢下滑速度,使局部VEGF高表達維持較長時間 (術后第14天)。我們推斷,骨折一號方在骨折愈合過程中,具有正向調高VEGF表達水平的能力,同時可減緩表達峰值后表達量下降的速度,延長局部VEGF高表達時間,促進骨折斷端微血管新生增殖,使骨折斷端血循環重建及成骨過程加快,縮短骨折愈合時間。

BMP-2是公認的最主要的骨形成調控因子,體內和體外實驗都證明BMP-2有很強的促進成骨細胞分化和誘導體外成骨的能力[5-6]。本實驗BMP-2表達檢測結果顯示,骨折后斷端均有BMP-2表達。我們所觀察的各時相點未出現峰值,而是呈兩條近乎平行線,隨時間的推移而呈增高趨勢。這可能與我們所選的觀察時相點相對短有關。在各時相點,骨折一號方組BMP-2表達均高于對照組和空白組 (P＜0.05)。由此推測,骨折一號方對BMP-2的合成、分泌具有一定的干預作用,能增加其表達量,從而促進骨折愈合和縮短骨折愈合時間。

綜上所述,骨折一號方能顯著增高骨折愈合各時相點VEGF、BMP-2的表達量,使骨折斷端血循環重建及成骨過程加快,這可能是其產生臨床療效的機制之一。本實驗僅研究了骨折一號方對骨折早期的影響,其對骨折中后期的影響有待進一步探討。

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